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U musculu scheletricu hè un tissutu eterogeneu cumpostu principalmente da miofibrille, chì in l'omu sò tipicamente classificate in trè tippi: unu "lentu" (tipu 1) è dui "veloci" (tipi 2A è 2X). Tuttavia, l'eterogeneità trà è in i tipi tradiziunali di miofibrille ferma pocu capita. Avemu applicatu approcci trascrittomici è proteomici à 1050 è 1038 miofibrille individuali di u vastus lateralis umanu, rispettivamente. U studiu proteomicu hà inclusu omi, è u studiu trascrittomicu hà inclusu 10 omi è 2 donne. In più di l'isoforme di a catena pesante di miosina, avemu identificatu proteine metaboliche, proteine ribosomiali è proteine giunzionali cellulari cum'è fonti di variabilità intermiofibrillare multidimensionale. Inoltre, malgradu l'identificazione di gruppi di fibre lente è veloci, i nostri dati suggerenu chì e fibre di tipu 2X sò fenotipicamente indistinguibili da altre fibre à contrazione rapida. Inoltre, a classificazione basata nantu à a catena pesante di miosina hè insufficiente per discrive u fenotipu di e miofibre in e miopatie nemaline. In generale, i nostri dati suggerenu una eterogeneità di miofibre multidimensionale, cù fonti di variazione chì si estendenu oltre l'isoforme di a catena pesante di miosina.
L'eterogeneità cellulare hè una caratteristica inerente à tutti i sistemi biologichi, chì permette à e cellule di specializà si per risponde à i diversi bisogni di i tessuti è di e cellule.1 A visione tradiziunale di l'eterogeneità di e fibre musculari scheletriche hè stata chì i neuroni motori definiscenu u tipu di fibra in una unità motoria, è chì u tipu di fibra (vale à dì, tipu 1, tipu 2A è tipu 2X in l'omu) hè determinatu da e caratteristiche di l'isoformi di a catena pesante di miosina (MYH).2 Questu era inizialmente basatu annantu à a so instabilità di pH ATPasi,3,4 è dopu annantu à a so espressione moleculare di MYH.5 Tuttavia, cù l'identificazione è a successiva accettazione di fibre "miste" chì coesprimenu parechji MYH in proporzioni variabili, e fibre musculari scheletriche sò sempre più viste cum'è un continuum piuttostu chè cum'è tipi di fibre distinti.6 Malgradu questu, u campu si basa sempre assai nantu à MYH cum'è u classificatore primariu per a classificazione di e miofibre, una visione probabilmente influenzata da e limitazioni è i pregiudizii significativi di i primi studii nantu à i roditori chì i so profili d'espressione MYH è a gamma di tipi di fibre differiscenu da quelli in l'omu.2 A situazione hè ulteriormente cumplicata da u fattu chì diversi musculi scheletrici umani mostranu una gamma diversa di tipi di fibre.7 U U vastus lateralis hè un musculu mistu cù un prufilu d'espressione MYH intermediu (è dunque rappresentativu).7 Inoltre, a so facilità di campionamentu ne face u musculu megliu studiatu in l'omu.
Cusì, l'investigazione imparziale di a diversità di e fibre musculari scheletriche cù l'usu di putenti strumenti "omici" hè critica ma ancu sfida, in parte per via di a natura multinucleata di e fibre musculari scheletriche. Tuttavia, e tecnulugie di trascrittomica8,9 è proteomica10 anu subitu una rivoluzione in a sensibilità in l'ultimi anni per via di vari progressi tecnologichi, chì permettenu l'analisi di u musculu scheletricu à risoluzione di una sola fibra. Di cunsiguenza, sò stati fatti progressi significativi in a caratterizazione di a diversità di una sola fibra è a so risposta à stimuli atrofichi è à l'invecchiamentu11,12,13,14,15,16,17,18. Impurtantemente, sti progressi tecnologichi anu applicazioni cliniche, chì permettenu una caratterizazione più dettagliata è precisa di a disregulazione assuciata à a malatia. Per esempiu, a fisiopatologia di a miopatia nemalina, una di e malatie musculari ereditarie più cumuni (MIM 605355 è MIM 161800), hè cumplessa è cunfusa.19,20 Dunque, una megliu caratterizazione di a disregulazione di e fibre musculari scheletriche puderia purtà à progressi significativi in a nostra comprensione di sta malatia.
Avemu sviluppatu metudi per l'analisi trascrittomica è proteomica di fibre musculari scheletriche singole isolate manualmente da campioni di biopsia umana è applicate à migliaia di fibre, chì ci permettenu di investigà l'eterogeneità cellulare di e fibre musculari scheletriche umane. In u corsu di stu travagliu, avemu dimustratu u putere di a fenotipizzazione trascrittomica è proteomica di e fibre musculari è identificatu e proteine giunczionali metaboliche, ribosomiali è cellulari cum'è fonti significative di variabilità interfibra. Inoltre, utilizendu stu flussu di travagliu proteomicu, avemu caratterizatu a rilevanza clinica di a miopatia di nematodi in fibre musculari scheletriche singole, rivelendu un cambiamentu coordinatu versu fibre non ossidattive indipendenti da u tipu di fibra basatu annantu à MYH.
Per investigà l'eterogeneità di e fibre musculari scheletriche umane, avemu sviluppatu dui flussi di travagliu per permette l'analisi di u trascrittoma è di u proteoma di e singole fibre musculari scheletriche (Figura 1A è Figura Supplementare 1A). Avemu sviluppatu è ottimizatu parechji passi metodologichi, da u almacenamentu di i campioni è a preservazione di l'integrità di l'RNA è di e proteine à l'ottimizazione di u rendimentu per ogni approcciu. Per l'analisi di u trascrittoma, questu hè statu ottenutu inserendu codici à barre moleculari specifichi di u campione à u passu iniziale di a trascrizione inversa, permettendu di raggruppà 96 fibre per un'elaborazione downstream efficiente. Un sequenziamentu più prufondu (± 1 milione di letture per fibra) paragunatu à l'approcci tradiziunali à una sola cellula hà arricchitu ulteriormente i dati di u trascrittoma. 21 Per a proteomica, avemu utilizatu un gradiente cromatograficu cortu (21 minuti) cumminatu cù l'acquisizione di dati DIA-PASEF nantu à un spettrometru di massa timsTOF per ottimizà a prufundità di u proteoma mantenendu un rendimentu elevatu. 22,23 Per investigà l'eterogeneità di e fibre musculari scheletriche sane, avemu carattarizatu i trascrittomi di 1.050 fibre individuali da 14 donatori adulti sani è i proteomi di 1.038 fibre da 5 donatori adulti sani (Tabella Supplementare 1). In questu articulu, questi insemi di dati sò chjamati rispettivamente trascrittomi è proteomi di 1.000 fibre. U nostru approcciu hà rilevatu un totale di 27.237 trascritti è 2.983 proteine in l'analisi trascrittomiche è proteomiche di 1.000 fibre (Figura 1A, Insemi di dati supplementari 1-2). Dopu avè filtratu l'insemi di dati trascrittomici è proteomici per >1.000 geni rilevati è valori validi di u 50% per fibra, sò state effettuate analisi bioinformatiche successive per 925 è 974 fibre in u trascrittoma è in u proteoma, rispettivamente. Dopu à u filtraggio, una media di 4257 ± 1557 geni è 2015 ± 234 proteine (media ± SD) sò state rilevate per fibra, cù una variabilità interindividuale limitata (Figure Supplementari 1B-C, Dataset Supplementari 3-4). Tuttavia, a variabilità intra-sughjettu era più pronunciata trà i participanti, probabilmente per via di e differenze in u rendimentu di RNA/proteine trà fibre di diverse lunghezze è aree di sezione trasversale. Per a maiò parte di e proteine (>2000), u coefficientu di variazione era inferiore à u 20% (Figura Supplementare 1D). Tramindui i metudi anu permessu di catturà una vasta gamma dinamica di trascritti è proteine cù firme altamente espresse impurtanti per a cuntrazione musculare (per esempiu, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figure Supplementari 1E-F). A maiò parte di e caratteristiche identificate eranu cumuni trà i datasets trascrittomichi è proteomichi (Figura Supplementare 1G), è l'intensità medie UMI/LFQ di queste caratteristiche eranu abbastanza bè correlate (r = 0,52) (Figura Supplementare 1H).
Flussu di travagliu di trascrittomica è proteomica (creatu cù BioRender.com). Curve di gamma dinamica BD per MYH7, MYH2 è MYH1, è soglie calculate per l'assegnazione di u tipu di fibra. E, F Distribuzione di l'espressione MYH trà e fibre in i datasets di trascrittomica è proteomica. G, H Grafici di approssimazione è pruiezione di a diversità uniforme (UMAP) per a trascrittomica è a proteomica culurati per u tipu di fibra basatu annantu à MYH. I, J Grafici di caratteristiche chì mostranu l'espressione MYH7, MYH2 è MYH1 in i datasets di trascrittomica è proteomica.
Inizialmente, avemu decisu d'assignà un tipu di fibra basatu annantu à MYH à ogni fibra utilizendu un approcciu ottimizatu chì sfrutta l'alta sensibilità è a gamma dinamica di l'espressione MYH in i datasets omichi. Studi precedenti anu utilizatu soglie arbitrarie per etichettà e fibre cum'è tipu 1 puru, tipu 2A, tipu 2X, o miste basatu annantu à una percentuale fissa di espressione di diversi MYH11,14,24. Avemu utilizatu un approcciu diversu in u quale l'espressione di ogni fibra hè stata classificata secondu i MYH chì avemu utilizatu per tipificà e fibre: MYH7, MYH2 è MYH1, currispondenti à e fibre di tipu 1, tipu 2A è tipu 2X, rispettivamente. Dopu avemu calculatu matematicamente u puntu di flessu inferiore di ogni curva risultante è l'avemu utilizatu cum'è soglia per assignà e fibre cum'è pusitive (sopra a soglia) o negative (sottu a soglia) per ogni MYH (Figura 1B-D). Quessi dati dimustranu chì MYH7 (Figura 1B) è MYH2 (Figura 1C) anu profili d'espressione on/off più distinti à u livellu di l'ARN paragunatu à u livellu di e proteine. Infatti, à u livellu di e proteine, assai poche fibre ùn esprimevanu micca MYH7, è nisuna fibra avia una espressione di MYH2 di 100%. Dopu avemu utilizatu limiti d'espressione predeterminati per assignà i tipi di fibre basati nantu à MYH à tutte e fibre in ogni inseme di dati. Per esempiu, e fibre MYH7+/MYH2-/MYH1- sò state assignate à u tipu 1, mentre chì e fibre MYH7-/MYH2+/MYH1+ sò state assignate à u tipu mistu 2A/2X (vede a Tabella Supplementare 2 per una descrizzione cumpleta). Mettendu in cumunu tutte e fibre, avemu osservatu una distribuzione notevolmente simile di i tipi di fibre basati nantu à MYH sia à u livellu di RNA (Figura 1E) sia à quellu di e proteine (Figura 1F), mentre chì a cumpusizione relativa di i tipi di fibre basati nantu à MYH variava trà l'individui, cum'è previstu (Figura Supplementare 2A). A maiò parte di e fibre sò state classificate cum'è tipu 1 puru (34-35%) o tipu 2A (36-38%), ancu s'è un numeru significativu di fibre di tipu mistu 2A/2X sò state ancu rilevate (16-19%). Una differenza sorprendente hè chì e fibre pure di tipu 2X puderanu esse rilevate solu à u livellu di l'ARN, ma micca à u livellu di e proteine, ciò chì suggerisce chì l'espressione rapida di MYH hè almenu parzialmente regulata post-trascrizione.
Avemu validatu u nostru metudu di tipizzazione di e fibre MYH basatu annantu à a proteomica utilizendu u dot blotting basatu annantu à l'anticorpi, è i dui metudi anu ottenutu un accordu di 100% in l'identificazione di fibre pure di tipu 1 è di tipu 2A (vede a Figura Supplementare 2B). Tuttavia, l'approcciu basatu annantu à a proteomica era più sensibile, più efficiente in l'identificazione di fibre miste è a quantificazione di a proporzione di ogni genu MYH in ogni fibra. Quessi dati dimustranu l'efficacia di l'usu di un approcciu obiettivu è altamente sensibile basatu annantu à l'omica per caratterizà i tipi di fibre musculari scheletriche.
Avemu tandu utilizatu l'infurmazioni cumminate furnite da a trascrittomica è a proteomica per classificà obiettivamente e miofibre basatu annantu à u so trascrittoma o proteoma cumpletu. Usendu u metudu di l'approssimazione è di a pruiezione di a varietà uniforme (UMAP) per riduce a dimensionalità à sei cumpunenti principali (Figure Supplementari 3A-B), simu stati capaci di visualizà a variabilità di e miofibre in u trascrittoma (Figura 1G) è in u proteoma (Figura 1H). In particulare, e miofibre ùn sò state raggruppate per participanti (Figure Supplementari 3C-D) o per ghjorni di test (Figura Supplementare 3E) nè in i datasets di trascrittomica nè in quelli di proteomica, ciò chì suggerisce chì a variabilità intra-sughjettu in e fibre musculari scheletriche hè più alta di a variabilità trà i sughjetti. In u graficu UMAP, sò emersi dui gruppi distinti chì rapprisentanu e miofibre "veloci" è "lente" (Figure 1G-H). E miofibre MYH7+ (lente) eranu raggruppate à u polu pusitivu di UMAP1, mentre chì e miofibre MYH2+ è MYH1+ (veloci) eranu raggruppate à u polu negativu di UMAP1 (Figure 1I-J). Tuttavia, ùn hè stata fatta alcuna distinzione trà i tipi di fibre à contrazione rapida (vale à dì, tipu 2A, tipu 2X, o 2A/2X misti) basata annantu à l'espressione MYH, ciò chì suggerisce chì l'espressione di MYH1 (Figura 1I-J) o altri marcatori di miofibre 2X classici cum'è ACTN3 o MYLK2 (Figure supplementari 4A-B) ùn face micca differenza trà i diversi tipi di miofibre quandu si cunsidereghja tuttu u trascrittoma o proteoma. Inoltre, paragunatu à MYH2 è MYH7, pochi trascritti o proteine eranu pusitivamente correlati cù MYH1 (Figure supplementari 4C-H), ciò chì suggerisce chì l'abbundanza di MYH1 ùn riflette micca cumpletamente u trascrittoma/proteoma di e miofibre. Cunclusioni simili sò state ghjunte quandu si valutava l'espressione mista di e trè isoforme MYH à u livellu UMAP (Figure supplementari 4I-J). Cusì, mentre e fibre 2X ponu esse identificate à u livellu di trascrizione basatu solu nantu à a quantificazione MYH, e fibre MYH1+ ùn sò micca distinguibili da altre fibre veloci quandu si cunsidereghja tuttu u trascritoma o proteoma.
Cum'è una prima esplorazione di l'eterogeneità di e fibre lente al di là di MYH, avemu valutatu quattru proteine specifiche di tipu di fibre lente stabilite: TPM3, TNNT1, MYL3 è ATP2A22. I sottotipi di fibre lente anu mostratu correlazioni di Pearson elevate, ancu se micca perfette, cù MYH7 sia in trascrittomica (Figura Supplementare 5A) sia in proteomica (Figura Supplementare 5B). Circa u 25% è u 33% di e fibre lente ùn sò state classificate cum'è fibre lente pure da tutti i sottotipi di geni / proteine in trascrittomica (Figura Supplementare 5C) è proteomica (Figura Supplementare 5D), rispettivamente. Dunque, a classificazione di e fibre lente basata annantu à più sottotipi di geni / proteine introduce una cumplessità supplementaria, ancu per e proteine scone per esse specifiche di tipu di fibra. Questu suggerisce chì a classificazione di e fibre basata annantu à isoforme di una sola famiglia di geni / proteine ùn pò micca riflette adeguatamente a vera eterogeneità di e fibre musculari scheletriche.
Per esplorà ulteriormente a variabilità fenotipica di e fibre musculari scheletriche umane à a scala di u mudellu omicu cumpletu, avemu realizatu una riduzione di a dimensionalità imparziale di i dati utilizendu l'analisi di i cumpunenti principali (PCA) (Figura 2A). Simile à i grafici UMAP, nè u participante nè u ghjornu di prova anu influenzatu u raggruppamentu di fibre à u livellu PCA (Figure Supplementari 6A-C). In i dui insemi di dati, u tipu di fibra basatu annantu à MYH hè statu spiegatu da PC2, chì hà mostratu un cluster di fibre di tipu 1 à contrazione lenta è un secondu cluster chì cuntene fibre di tipu 2A à contrazione rapida, di tipu 2X è miste 2A/2X (Figura 2A). In i dui insemi di dati, questi dui cluster eranu cunnessi da un picculu numeru di fibre di tipu 1/2A miste. Cum'è previstu, l'analisi di sovrarappresentazione di i principali driver PC hà cunfirmatu chì PC2 era guidatu da firme contrattili è metaboliche (Figura 2B è Figure Supplementari 6D-E, Insemi di dati Supplementari 5-6). In generale, u tipu di fibra basatu annantu à MYH hè statu trovu sufficiente per spiegà a variazione cuntinua longu PC2, cù l'eccezzione di e cusì dette fibre 2X chì eranu distribuite in tuttu u trascrittoma in u cluster veloce.
A. Grafici di l'analisi di i cumpunenti principali (PCA) di i datasets di trascrittoma è proteoma culurati secondu u tipu di fibra basatu annantu à MYH. B. Analisi di arricchimentu di i driver di trascritti è proteine in PC2 è PC1. L'analisi statistica hè stata realizata utilizendu u pacchettu clusterProfiler è i valori p aghjustati da Benjamini-Hochberg. C, D. Grafici PCA culurati secondu i termini di l'ontologia di u genu di adesione intercellulare (GO) in u trascrittoma è i termini GO di u costameru in u proteoma. E frecce rapprisentanu i driver di trascritti è proteine è e so direzzione. E, F. Grafici di l'approssimazione è di a pruiezione di a varietà uniforme (UMAP) di caratteristiche clinicamente pertinenti chì mostranu gradienti d'espressione indipendenti da u tipu di fibra lenta/veloce. G, H. Correlazioni trà i driver PC2 è PC1 in trascrittomi è proteomi.
Inaspettatamente, u tipu di miofibra basatu annantu à MYH hà spiegatu solu u secondu gradu più altu di variabilità (PC2), chì suggerisce chì altri fattori biologichi senza relazione cù u tipu di miofibra basatu annantu à MYH (PC1) ghjocanu un rolu impurtante in a regulazione di l'eterogeneità di e fibre musculari scheletriche. L'analisi di sovrarappresentazione di i principali driver in PC1 hà rivelatu chì a variabilità in PC1 era principalmente determinata da l'adesione cellula-cellula è u cuntenutu di ribosomi in u trascrittoma, è i costameri è e proteine ribosomiali in u proteoma (Figura 2B è Figure Supplementari 6D-E, Set di Dati Supplementari 7). In u musculu scheletricu, i costameri cunnettanu u discu Z à u sarcolemma è sò implicati in a trasmissione è a segnalazione di a forza. 25 I grafici PCA annotati chì utilizanu e caratteristiche di l'adesione cellula-cellula (trascrittoma, Figura 2C) è di i costameri (proteoma, Figura 2D) anu rivelatu un forte spostamentu à manca in PC1, chì indica chì queste caratteristiche sò arricchite in certe fibre.
Un esame più dettagliatu di u raggruppamentu di miofibre à u livellu UMAP hà rivelatu chì a maiò parte di e caratteristiche anu mostratu un gradiente d'espressione basatu annantu à MYH indipendente da u tipu di miofibra piuttostu chè specificu per u sottocluster di miofibre. Questa continuità hè stata osservata per parechji geni assuciati à cundizioni patologiche (Figura 2E), cum'è CHCHD10 (malattia neuromusculare), SLIT3 (atrofia musculare), CTDNEP1 (malattia musculare). Questa continuità hè stata osservata ancu in tuttu u proteoma, cumprese e proteine assuciate à disordini neurologichi (UGDH), a segnalazione di l'insulina (PHIP) è a trascrizione (HIST1H2AB) (Figura 2F). Cullettivamente, questi dati indicanu a continuità in l'eterogeneità di a contrazione lenta/veloce indipendente da u tipu di fibra in diverse miofibre.
Curiosamente, i geni driver in PC2 anu mostratu una bona currelazione trascrittoma-proteoma (r = 0,663) (Figura 2G), chì suggerisce chì i tipi di fibre à contrazione lenta è rapida, è in particulare e proprietà contrattili è metaboliche di e fibre musculari scheletriche, sò regulate trascrizionalmente. Tuttavia, i geni driver in PC1 ùn anu mostratu alcuna currelazione trascrittoma-proteoma (r = -0,027) (Figura 2H), chì suggerisce chì e variazioni micca correlate à i tipi di fibre à contrazione lenta/rapida sò largamente regulate post-trascrizionalmente. Siccome e variazioni in PC1 sò state spiegate principalmente da termini di ontologia di i geni ribosomiali, è datu chì i ribosomi ghjocanu un rolu cruciale è specializatu in a cellula participendu attivamente è influenzendu a traduzzione di e proteine,31 avemu dopu decisu di investigà sta eterogeneità ribosomiale inaspettata.
Avemu prima culuritu u graficu di l'analisi di i cumpunenti principali di a proteomica secondu l'abbundanza relativa di e proteine in u termine GOCC "ribosomu citoplasmaticu" (Figura 3A). Ancu s'è stu termine hè arricchitu da u latu pusitivu di PC1, risultendu in un picculu gradiente, e proteine ribosomiali guidanu a partizione in e duie direzzione di PC1 (Figura 3A). E proteine ribosomiali arricchite da u latu negativu di PC1 includenu RPL18, RPS18 è RPS13 (Figura 3B), mentre chì RPL31, RPL35 è RPL38 (Figura 3C) eranu i principali motori da u latu pusitivu di PC1. Hè interessante nutà chì RPL38 è RPS13 eranu assai espressi in u musculu scheletricu paragunatu à altri tessuti (Figura Supplementare 7A). Queste firme ribosomiali distintive in PC1 ùn sò state osservate in u trascrittoma (Figura Supplementare 7B), indicendu una regulazione post-trascrizionale.
A. Graficu di l'analisi di i cumpunenti principali (PCA) culuratu secondu i termini di l'ontologia di u genu ribosomiale citoplasmaticu (GO) in tuttu u proteoma. E frecce indicanu a direzzione di a variazione mediata da e proteine in u graficu PCA. A lunghezza di a linea currisponde à u puntu di u cumpunente principale per una data proteina. B, C. Grafici di e caratteristiche PCA per RPS13 è RPL38. D. Analisi di clustering gerarchicu senza supervisione di e proteine ribosomiali citoplasmatiche. E. Modellu strutturale di u ribosomu 80S (PDB: 4V6X) chì mette in risaltu e proteine ribosomiali cù diverse abbundanze in e fibre musculari scheletriche. F. Proteine ribosomiali cù diverse stechiometrie lucalizzate vicinu à u canale di uscita di l'mRNA.
I cuncetti di eterogeneità è specializazione ribosomiale sò stati pruposti prima, per via di i quali a presenza di distinte sottopopolazioni di ribosomi (eterogeneità ribosomiale) pò influenzà direttamente a traduzzione di e proteine in diversi tessuti32 è cellule33 attraversu a traduzzione selettiva di specifici gruppi di trascritti di mRNA34 (specializazione ribosomiale). Per identificà e sottopopolazioni di proteine ribosomiali coespresse in e fibre musculari scheletriche, avemu realizatu un'analisi di clustering gerarchicu senza supervisione di proteine ribosomiali in u proteoma (Figura 3D, Set di Dati Supplementari 8). Cum'è previstu, e proteine ribosomiali ùn si sò micca raggruppate per tipu di fibra basatu annantu à MYH. Tuttavia, avemu identificatu trè gruppi distinti di proteine ribosomiali; u primu cluster (ribosomal_cluster_1) hè coregulatu cù RPL38 è dunque hà una maggiore espressione in fibre cù un prufilu PC1 pusitivu. U secondu cluster (ribosomal_cluster_2) hè coregulatu cù RPS13 è hè elevatu in fibre cù un prufilu PC1 negativu. U terzu gruppu (ribosomal_cluster_3) ùn mostra micca una espressione differenziale coordinata in e fibre musculari scheletriche è pò esse cunsideratu a proteina ribosomiale "core" di u musculu scheletricu. Tramindui i gruppi ribosomiali 1 è 2 cuntenenu proteine ribosomiali chì sò state precedentemente dimustrate per regulà a traduzzione alternativa (per esempiu, RPL10A, RPL38, RPS19 è RPS25) è influenzanu funziunalmente u sviluppu (per esempiu, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 In cunfurmità cù i risultati di PCA, a rapprisentazione eterogenea osservata di queste proteine ribosomiali in tutte e fibre hà ancu mostratu continuità (Figura Supplementare 7C).
Per visualizà a situazione di e proteine ribosomiali eterogenee in u ribosomu, avemu utilizatu un mudellu strutturale di u ribosomu umanu 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Dopu avè isolatu e proteine ribosomiali appartenenti à diversi gruppi ribosomiali, e so situazioni ùn eranu micca strettamente allineate, ciò chì suggerisce chì u nostru approcciu ùn hè micca riesciutu à furnisce arricchimentu per certe regioni/frazioni di u ribosomu. Hè interessante, però, chì a proporzione di proteine à grande subunità in u gruppu 2 era più bassa chè in i gruppi 1 è 3 (Figura Supplementare 7D). Avemu osservatu chì e proteine cù stechiometria alterata in e fibre musculari scheletriche eranu principalmente lucalizzate nantu à a superficia di u ribosomu (Figura 3E), coerente cù a so capacità di interagisce cù l'elementi interni di u situ d'entrata di u ribosomu (IRES) in diverse pupulazioni di mRNA, coordinendu cusì a traduzzione selettiva. 40, 41 Inoltre, parechje proteine cù stechiometria alterata in e fibre musculari scheletriche eranu situate vicinu à e regioni funziunali cum'è u tunnel di uscita di l'mRNA (Figura 3F), chì regulanu selettivamente l'allungamentu traduzionale è l'arrestu di peptidi specifici. 42 In riassuntu, i nostri dati suggerenu chì a stechiometria di e proteine ribosomali di u musculu scheletricu presenta eterogeneità, ciò chì risulta in differenze trà e fibre musculari scheletriche.
Dopu, avemu cuminciatu à identificà e firme di fibre à contrazione rapida è lenta è à esplorà i meccanismi di a so regulazione trascrizionale. Cumparendu i gruppi di fibre à contrazione rapida è lenta definiti da UMAP in i dui datasets (Figure 1G-H è 4A-B), l'analisi trascrittomiche è proteomiche anu identificatu rispettivamente 1366 è 804 caratteristiche differenzialmente abbundanti (Figure 4A-B, Datasets Supplementari 9-12). Avemu osservatu e differenze previste in e firme relative à i sarcomeri (per esempiu, tropomiosina è troponina), l'accoppiamentu eccitazione-contrazione (isoforme SERCA) è u metabolismu energeticu (per esempiu, ALDOA è CKB). Inoltre, i trascritti è e proteine chì regulanu l'ubiquitinazione di e proteine sò stati espressi in modu differenziale in e fibre à contrazione rapida è lenta (per esempiu, USP54, SH3RF2, USP28 è USP48) (Figure 4A-B). Inoltre, u genu di a proteina microbica RP11-451G4.2 (DWORF), chì hè statu dimustratu in precedenza esse espressu in modu differenziale trà i tipi di fibre musculari di l'agnello43 è aumenta l'attività SERCA in u musculu cardiacu44, era significativamente sovraregulatu in e fibre musculari scheletriche lente (Figura 4A). In listessu modu, à u livellu di e singole fibre, sò state osservate differenze significative in e firme cunnisciute cum'è l'isoformi di a lattato deidrogenasi legate à u metabolismu (LDHA è LDHB, Figura 4C è Figura Supplementare 8A)45,46 è ancu firme specifiche di u tipu di fibra precedentemente scunnisciute (cum'è IRX3, USP54, USP28 è DPYSL3) (Figura 4C). Ci era una sovrapposizione significativa di caratteristiche espresse in modu differenziale trà i datasets trascrittomici è proteomici (Figura Supplementare 8B), è ancu una currelazione di cambiamentu di piega guidata principalmente da l'espressione differenziale più pronunciata di e caratteristiche di u sarcomero (Figura Supplementare 8C). In particulare, alcune firme (per esempiu USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) anu mostratu una forte regulazione post-trascrizionale solu à u livellu proteomicu è avianu profili d'espressione specifichi di u tipu di fibra à contrazione lenta / veloce (Figura Supplementare 8C).
Grafici di vulcani A è B chì paragunanu cluster lenti è veloci identificati da i grafici di approssimazione è pruiezione di manifold uniforme (UMAP) in e Figure 1G-H. I punti culuriti rapprisentanu trascritti o proteine chì sò significativamente diverse à FDR < 0,05, è i punti più scuri rapprisentanu trascritti o proteine chì sò significativamente diverse à cambiamentu di log > 1. L'analisi statistica bidirezionale hè stata realizata utilizendu u test DESeq2 Wald cù valori p aghjustati da Benjamini-Hochberg (trascrittomica) o u metudu di u mudellu lineare Limma cù analisi bayesiana empirica seguita da aghjustamentu di Benjamini-Hochberg per paragoni multipli (proteomica). C Grafici di firma di geni o proteine espressi in modu differenziale selezziunati trà fibre lente è veloci. D Analisi di arricchimentu di trascritti è proteine espressi in modu differenziale significativamente. I valori sovrapposti sò arricchiti in entrambi i dataset, i valori di u trascrittoma sò arricchiti solu in u trascrittoma, è i valori di u proteoma sò arricchiti solu in u proteoma. L'analisi statistica hè stata realizata utilizendu u pacchettu clusterProfiler cù valori p aghjustati da Benjamini-Hochberg. E. Fattori di trascrizione specifichi di u tipu di fibra identificati da SCENIC basati nantu à i punteggi di specificità di u regulatore derivati da SCENIC è l'espressione differenziale di mRNA trà i tipi di fibre. F. Prufilatura di fattori di trascrizione selezziunati espressi in modu differenziale trà fibre lente è veloci.
Avemu dopu realizatu un'analisi di sovrarappresentazione di geni è proteine rapprisentati in modu differenziale (Figura 4D, Set di Dati Supplementari 13). L'arricchimentu di e vie per e caratteristiche chì differianu trà i dui set di dati hà rivelatu differenze previste, cum'è i prucessi di β-ossidazione di l'acidi grassi è di u metabolismu di i chetoni (fibre lente), a cuntrazione di miofilamenti/musculi (fibre veloci è lente, rispettivamente) è i prucessi catabolici di i carboidrati (fibre veloci). L'attività di a proteina fosfatasi serina/treonina era ancu elevata in e fibre veloci, guidata da caratteristiche cum'è e subunità fosfatasi regulatorie è catalitiche (PPP3CB, PPP1R3D è PPP1R3A), chì sò cunnisciute per regulà u metabolismu di u glicogenu (47) (Figure Supplementari 8D-E). Altre vie arricchite in fibre veloci includenu corpi di trasfurmazione (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) in u proteoma (Figura Supplementare 8F), potenzialmente implicati in a regulazione post-trascrizionale (48), è l'attività di u fattore di trascrizione (SREBF1, RXRG, RORA) in u trascrittoma (Figura Supplementare 8G). E fibre lente sò state arricchite in attività di ossidoreduttasi (BDH1, DCXR, TXN2) (Figura Supplementare 8H), legame amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figura Supplementare 8I), matrice extracellulare (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figura Supplementare 8J), è attività di ligandi recettori (FNDC5, SPX, NENF) (Figura Supplementare 8K).
Per ottene più infurmazioni nantu à a regulazione trascrizionale chì hè à a basa di e caratteristiche di u tipu di fibre musculari lente/veloci, avemu realizatu un'analisi di arricchimentu di i fattori di trascrizione utilizendu SCENIC49 (Set di Dati Supplementari 14). Parechji fattori di trascrizione sò stati significativamente arricchiti trà e fibre musculari veloci è lente (Figura 4E). Questu includeva fattori di trascrizione cum'è MAFA, chì hè statu prima ligatu à u sviluppu rapidu di e fibre musculari,50 è ancu parechji fattori di trascrizione micca prima assuciati à prugrammi genichi specifichi di u tipu di fibra musculare. Trà questi, PITX1, EGR1 è MYF6 eranu i fattori di trascrizione più arricchiti in e fibre musculari veloci (Figura 4E). In cuntrastu, ZSCAN30 è EPAS1 (cunnisciutu ancu cum'è HIF2A) eranu i fattori di trascrizione più arricchiti in e fibre musculari lente (Figura 4E). In cunfurmità cù questu, MAFA hè statu espressu à livelli più alti in a regione UMAP currispondente à e fibre musculari veloci, mentre chì EPAS1 avia u schema di espressione oppostu (Figura 4F).
In più di i geni cunnisciuti chì codificanu e proteine, ci sò numerosi biotipi di RNA non codificanti chì ponu esse implicati in a regulazione di u sviluppu umanu è di e malatie. 51, 52 In i datasets di trascrittoma, parechji RNA non codificanti mostranu specificità di tipu di fibra (Figura 5A è Dataset Supplementare 15), cumpresu LINC01405, chì hè assai specificu per e fibre lente è hè statu signalatu cum'è diminuitu in u musculu di i pazienti cun miopatia mitocondriale. 53 In cuntrastu, RP11-255P5.3, currispondente à u genu lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, mostra specificità di tipu di fibra veloce. Sia LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) sia RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) mostranu specificità di u musculu scheletricu (Figure Supplementari 9A-B) è ùn anu micca geni cuntrattili cunnisciuti in u so quartieru genomicu di 1 Mb, ciò chì suggerisce ch'elli ghjocanu un rolu specializatu in a regulazione di i tipi di fibre piuttostu chè in a regulazione di i geni cuntrattili vicini. I profili d'espressione specifichi di u tipu di fibra lenta/veloce di LINC01405 è RP11-255P5.3, rispettivamente, sò stati cunfirmati cù RNAscope (Figure 5B-C).
A. I trascritti di RNA non codificanti sò significativamente regulati in e fibre musculari à contrazione lenta è rapida. B. Immagini rappresentative di RNAscope chì mostranu a specificità di u tipu di fibra à contrazione lenta è rapida di LINC01405 è RP11-255P5.3, rispettivamente. Barra di scala = 50 μm. C. Quantificazione di l'espressione di RNA non codificante specifica di u tipu di miofibra cum'è determinata da RNAscope (n = 3 biopsie da individui indipendenti, paragunendu e fibre musculari veloci è lente in ogni individuu). L'analisi statistica hè stata realizata utilizendu un test t di Student à duie code. I grafici à scatula mostranu a mediana è u primu è u terzu quartile, cù i baffi chì indicanu i valori minimi è massimi. D. Flussu di travagliu di identificazione di e proteine microbiche de novo (creatu cù BioRender.com). E. A proteina microbica LINC01405_ORF408:17441:17358 hè specificamente espressa in e fibre musculari scheletriche lente (n = 5 biopsie da participanti indipendenti, paragunendu e fibre musculari veloci è lente in ogni participante). L'analisi statistica hè stata realizata aduprendu u metudu di u mudellu lineare Limm cumminatu cù un approcciu bayesianu empiricu, seguitu da u metudu Benjamini-Hochberg per paraguni multipli cù aghjustamentu di u valore p. I grafichi à scatula mostranu a mediana, u primu è u terzu quartile, cù i baffi chì puntanu à i valori massimi/minimi.
Recentemente, studii anu dimustratu chì parechji trascritti putativi non codificanti codificanu proteine microbiche trascritte, alcune di e quali regulanu a funzione musculare. 44, 55 Per identificà e proteine microbiche cù una putenziale specificità di tipu di fibra, avemu cercatu u nostru inseme di dati di proteomi di 1000 fibre utilizendu un schedariu FASTA persunalizatu chì cuntene e sequenze di trascritti non codificanti (n = 305) truvate in u inseme di dati di trascrittomi di 1000 fibre (Figura 5D). Avemu identificatu 197 proteine microbiche da 22 trascritti diversi, 71 di i quali eranu regulati in modu differenziale trà e fibre musculari scheletriche lente è veloci (Figura Supplementare 9C è Inseme di Dati Supplementare 16). Per LINC01405, sò stati identificati trè prudutti proteici microbici, unu di i quali hà mostratu una specificità di fibra lenta simile à u so trascritto (Figura 5E è Figura Supplementare 9D). Cusì, avemu identificatu LINC01405 cum'è un genu chì codifica una proteina microbica specifica per e fibre musculari scheletriche lente.
Avemu sviluppatu un flussu di travagliu cumpletu per a caratterizazione proteomica à grande scala di e fibre musculari individuali è avemu identificatu i regulatori di l'eterogeneità di e fibre in stati sani. Avemu applicatu questu flussu di travagliu per capisce cumu e miopatie nemaline affettanu l'eterogeneità di e fibre musculari scheletriche. E miopatie nemaline sò malatie musculari ereditarie chì causanu debulezza musculare è, in i zitelli affetti, si presentanu cù una varietà di cumplicazioni cumprese distress respiratoriu, scoliosi è mobilità limitata di l'arti. 19,20 Tipicamente, in e miopatie nemaline, e varianti patogene in geni cum'è l'actina alfa 1 (ACTA1) risultanu in una predominanza di a cumpusizione di miofibre di fibre à contrazione lenta, ancu se questu effettu hè eterogeneu. Una eccezione notevule hè a miopatia nemalina da troponina T1 (TNNT1), chì hà una predominanza di fibre veloci. Cusì, una megliu comprensione di l'eterogeneità chì hè à a basa di a disregulazione di e fibre musculari scheletriche osservata in e miopatie nemaline pò aiutà à svelà a relazione cumplessa trà queste malatie è u tipu di miofibre.
In paragone cù i cuntrolli sani (n = 3 per gruppu), e miofibre isolate da i pazienti cun miopatia nemalina cun mutazioni in i geni ACTA1 è TNNT1 anu mostratu una marcata atrofia o distrofia di e miofibre (Figura 6A, Tabella Supplementare 3). Questu hà presentatu sfide tecniche significative per l'analisi proteomica per via di a quantità limitata di materiale dispunibule. Malgradu questu, simu stati capaci di rilevà 2485 proteine in 272 miofibre scheletriche. Dopu avè filtratu almenu 1000 proteine quantificate per fibra, 250 fibre sò state sottumesse à una successiva analisi bioinformatica. Dopu u filtraggio, una media di 1573 ± 359 proteine per fibra sò state quantificate (Figura Supplementare 10A, Set di Dati Supplementari 17-18). In particulare, malgradu a significativa riduzione di a dimensione di e fibre, a prufundità di u proteoma di i campioni di pazienti cun miopatia nemalina hè stata solu modestamente ridutta. Inoltre, u trattamentu di sti dati cù i nostri propri fugliali FASTA (cumpresi i trascritti non codificanti) ci hà permessu di identificà cinque proteine microbiche in miofibre scheletriche di pazienti cun miopatia nemalina (Set di Dati Supplementari 19). A gamma dinamica di u proteoma era significativamente più larga, è e proteine totali in u gruppu di cuntrollu eranu ben correlate cù i risultati di una precedente analisi di u proteoma di 1000 fibre (Figura Supplementare 10B-C).
A. Imagine microscopiche chì mostranu l'atrofia o a distrofia di e fibre è a predominanza di diversi tipi di fibre basate nantu à MYH in miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1 (NM). Barra di scala = 100 μm. Per assicurà a riproducibilità di a culurazione in i pazienti ACTA1 è TNNT1, trè biopsie di pazienti sò state colorate duie o trè volte (quattru sezioni per casu) prima di selezziunà imagine rappresentative. B. Proporzioni di u tipu di fibra in i participanti basate nantu à MYH. C. Graficu di l'analisi di i cumpunenti principali (PCA) di e fibre musculari scheletriche in pazienti cù miopatie nemaline è cuntrolli. D. Fibre musculari scheletriche di pazienti cù miopatie nemaline è cuntrolli prughjettate nantu à un graficu PCA determinatu da e 1000 fibre analizzate in a Figura 2. Per esempiu, grafici di vulcano chì paragunanu e differenze trà i participanti cù miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1 è cuntrolli, è trà i participanti cù miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1. I cerchi culurati denotanu e proteine chì eranu significativamente diverse à π < 0,05, è i punti scuri denotanu e proteine chì eranu significativamente diverse à FDR < 0,05. L'analisi statistica hè stata realizata utilizendu u metudu di u mudellu lineare Limma è i metudi bayesiani empirichi, seguita da un aghjustamentu di u valore p per paragoni multipli utilizendu u metudu Benjamini-Hochberg. H. Analisi d'arricchimentu di proteine espresse in modu significativamente differenziale in tuttu u proteoma è in e fibre di tipu 1 è 2A. L'analisi statistica hè stata realizata utilizendu u pacchettu clusterProfiler è i valori p aghjustati da Benjamini-Hochberg. I, J. Grafici di l'analisi di i cumpunenti principali (PCA) culurati da a matrice extracellulare è i termini di l'ontologia di u gene mitocondriale (GO).
Siccomu e miopatie nemaline ponu influenzà a proporzione di i tipi di miofibre chì esprimenu MYH in u musculu scheletricu,19,20 avemu prima esaminatu i tipi di miofibre chì esprimenu MYH in i pazienti cun miopatie nemaline è i cuntrolli. Avemu determinatu u tipu di miofibre utilizendu un metudu imparziale discrittu prima per u test di 1000 miofibre (Figure supplementari 10D-E) è di novu ùn simu riesciuti à identificà e miofibre 2X pure (Figura 6B). Avemu osservatu un effettu eterogeneu di e miopatie nemaline nantu à u tipu di miofibre, postu chì dui pazienti cun mutazioni ACTA1 avianu una proporzione aumentata di miofibre di tipu 1, mentre chì dui pazienti cun miopatia nemaline TNNT1 avianu una proporzione diminuita di miofibre di tipu 1 (Figura 6B). Infatti, l'espressione di MYH2 è di l'isoformi di troponina rapida (TNNC2, TNNI2 è TNNT3) era diminuita in e miopatie ACTA1-nemaline, mentre chì l'espressione di MYH7 era diminuita in e miopatie TNNT1-nemaline (Figura Supplementare 11A). Questu hè coerente cù i rapporti precedenti di cambiamentu eterogeneu di u tipu di miofibre in e miopatie nemaline.19,20 Avemu cunfirmatu questi risultati per immunoistochimica è avemu trovu chì i pazienti cun miopatia ACTA1-nemaline avianu una predominanza di miofibre di tipu 1, mentre chì i pazienti cun miopatia TNNT1-nemaline avianu u schema oppostu (Figura 6A).
À u livellu di u proteoma di una sola fibra, e fibre musculari scheletriche di i pazienti cun miopatia nemalina ACTA1 è TNNT1 si sò raggruppate cù a maiò parte di e fibre di cuntrollu, cù e fibre di miopatia nemalina TNNT1 chì sò generalmente e più gravemente affettate (Figura 6C). Questu era particularmente evidente quandu si tracciavanu i grafici di l'analisi di i cumpunenti principali (PCA) di fibre pseudo-gonfiate per ogni paziente, cù i pazienti cun miopatia nemalina TNNT1 2 è 3 chì appariscenu i più distanti da i campioni di cuntrollu (Figura Supplementare 11B, Set di Dati Supplementari 20). Per capisce megliu cumu e fibre di i pazienti cun miopatia si paragunanu à e fibre sane, avemu utilizatu informazioni dettagliate ottenute da l'analisi proteomica di 1.000 fibre di participanti adulti sani. Avemu prughjettatu fibre da u set di dati di miopatia (pazienti è cuntrolli cun miopatia nemalina ACTA1 è TNNT1) nantu à u graficu PCA ottenutu da l'analisi proteomica di 1000 fibre (Figura 6D). A distribuzione di i tipi di fibre MYH longu PC2 in e fibre di cuntrollu era simile à a distribuzione di fibre ottenuta da l'analisi proteomica di 1000 fibre. Tuttavia, a maiò parte di e fibre in i pazienti cun miopatia nemalina si sò spostate versu PC2, sovrapponendu si cù fibre sane à contrazione rapida, indipendentemente da u so tipu di fibra MYH nativa. Cusì, ancu s'è i pazienti cun miopatia nemalina ACTA1 anu mostratu un spostamentu versu e fibre di tipu 1 quandu quantificate cù metudi basati nantu à MYH, sia a miopatia nemalina ACTA1 sia a miopatia nemalina TNNT1 anu spostatu u proteoma di e fibre musculari scheletriche versu e fibre à contrazione rapida.
Avemu tandu paragunatu direttamente ogni gruppu di pazienti cù cuntrolli sani è identificatu 256 è 552 proteine espresse in modu differenziale in e miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1, rispettivamente (Figura 6E-G è Figura Supplementare 11C, Set di Dati Supplementari 21). L'analisi di l'arricchimentu geneticu hà rivelatu una diminuzione coordinata di e proteine mitocondriali (Figura 6H-I, Set di Dati Supplementari 22). Sorprendentemente, malgradu a predominanza differenziale di i tipi di fibre in e miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1, sta diminuzione era cumpletamente indipendente da u tipu di fibra basatu annantu à MYH (Figura 6H è Figure Supplementari 11D-I, Set di Dati Supplementari 23). Trè proteine microbiche eranu ancu regulate in e miopatie nemaline ACTA1 o TNNT1. Dui di queste microproteine, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (cunnisciuta ancu cum'è LINC00598 o Lnc-FOXO1) è ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), anu mostratu una abbundanza differenziale solu in e miofibre di tipu 1. ENSG00000215483_TR14_ORF67 hè statu digià signalatu per ghjucà un rolu in a regulazione di u ciclu cellulare. 56 D’altronde, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (currispondente à LINC01798) hè statu aumentatu in e miofibre di tipu 1 è di tipu 2A in a miopatia ACTA1-nemalina paragunatu à i cuntrolli sani (Figura Supplementare 12A, Set di Dati Supplementare 24). In cuntrastu, e proteine ribosomali ùn eranu micca state affettate da a miopatia nemalina, ancu s'è RPS17 era sotturegulatu in a miopatia nemalina ACTA1 (Fig. 6E).
L'analisi di l'arricchimentu hà ancu revelatu una sovraespressione di i prucessi di u sistema immunitariu in e miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1, mentre chì l'adesione cellulare era ancu aumentata in a miopatia nemaline TNNT1 (Figura 6H). L'arricchimentu di sti fattori extracellulari hè statu riflessu da e proteine di a matrice extracellulare chì spustavanu PCA in PC1 è PC2 in una direzzione negativa (vale à dì, versu e fibre più affettate) (Figura 6J). Tramindui i gruppi di pazienti anu mostratu una maggiore espressione di proteine extracellulari implicate in e risposte immunitarie è in i meccanismi di riparazione sarcolemmale, cum'è l'annescine (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 è a so proteina interagente S100A1159 (Figure Supplementari 12B-C). Stu prucessu hè statu precedentemente signalatu cum'è miglioratu in e distrofie musculari60 ma, à a nostra cunniscenza, ùn hè statu precedentemente assuciatu à e miopatie nemaline. A funzione nurmale di sta macchina moleculare hè necessaria per a riparazione sarcolemmale dopu à una ferita è per a fusione di i miociti appena furmati cù e miofibre58,61. Cusì, l'aumentu di l'attività di stu prucessu in i dui gruppi di pazienti suggerisce una risposta riparativa à i danni causati da l'instabilità di e miofibre.
L'effetti di ogni miopatia nemalina eranu ben correlati (r = 0,736) è anu mostratu una sovrapposizione ragionevule (Figure Supplementari 11A-B), chì indicanu chì a miopatia nemalina ACTA1 è TNNT1 anu effetti simili nantu à u proteoma. Tuttavia, alcune proteine eranu regulate solu in a miopatia nemalina ACTA1 o TNNT1 (Figure Supplementari 11A è C). A proteina profibrotica MFAP4 era una di e proteine più sovraregulate in a miopatia nemalina TNNT1, ma hè rimasta invariata in a miopatia nemalina ACTA1. SKIC8, un cumpunente di u cumplessu PAF1C rispunsevule di a regulazione di a trascrizione di u genu HOX, era sotturegulatu in a miopatia nemalina TNNT1, ma ùn hè statu affettatu in a miopatia nemalina ACTA1 (Figura Supplementare 11A). A paragunazione diretta di a miopatia nemalina ACTA1 è TNNT1 hà rivelatu riduzioni più grande di e proteine mitocondriali è aumenti di e proteine di u sistema immunitariu in a miopatia nemalina TNNT1 (Figura 6G-H è Figure Supplementari 11C è 11H-I). Quessi dati sò coerenti cù a più grande atrofia/distrofia osservata in a miopatia nemalina TNNT1 paragunata à a miopatia nemalina TNNT1 (Figura 6A), ciò chì suggerisce chì a miopatia nemalina TNNT1 rapprisenta una forma più severa di a malattia.
Per valutà se l'effetti osservati di a miopatia nemalina persistenu à u livellu di tuttu u musculu, avemu realizatu un'analisi proteomica in massa di biopsie musculari da a stessa coorte di pazienti cun miopatia nemalina TNNT1 è li avemu paragunati cù i cuntrolli (n = 3 per gruppu) (Figura Supplementare 13A, Set di Dati Supplementari 25). Cum'è previstu, i cuntrolli eranu strettamente correlati in l'analisi di i cumpunenti principali, mentre chì i pazienti cun miopatia nemalina TNNT1 anu mostratu una variabilità intercampione più alta simile à quella osservata in l'analisi di una sola fibra (Figura Supplementare 13B). L'analisi in massa hà ripruduttu e proteine espresse in modu differenziale (Figura Supplementare 13C, Set di Dati Supplementari 26) è i prucessi biologichi (Figura Supplementare 13D, Set di Dati Supplementari 27) evidenziati paragunendu e fibre individuali, ma hà persu a capacità di distingue trà diversi tipi di fibre è ùn hà micca sappiutu tene contu di l'effetti eterogenei di a malattia in tutte e fibre.
Pigliati inseme, sti dati dimustranu chì a proteomica di una sola miofibra pò elucidà e caratteristiche biologiche cliniche chì ùn sò micca rilevabili da metudi mirati cum'è l'immunoblotting. Inoltre, sti dati mettenu in risaltu i limiti di l'usu di a tipizzazione di e fibre di actina (MYH) solu per discrive l'adattazione fenotipica. Infatti, ancu s'è u cambiamentu di u tipu di fibra differisce trà e miopatie nemaline di actina è troponina, entrambe e miopatie nemaline disaccoppianu a tipizzazione di e fibre MYH da u metabolismu di e fibre musculari scheletriche versu un proteoma musculare più veloce è menu ossidativu.
L'eterogeneità cellulare hè critica per chì i tessuti possinu risponde à e so diverse esigenze. In u musculu scheletricu, questu hè spessu discrittu cum'è tipi di fibre carattarizati da diversi gradi di pruduzzione di forza è fatigabilità. Tuttavia, hè chjaru chì questu spiega solu una piccula parte di a variabilità di e fibre musculari scheletriche, chì hè assai più variabile, cumplessa è sfaccettata di ciò chì si pensava prima. I progressi tecnologichi anu avà fattu luce nantu à i fattori chì regulanu e fibre musculari scheletriche. Infatti, i nostri dati suggerenu chì e fibre di tipu 2X ùn ponu micca esse un sottotipu distintu di fibre musculari scheletriche. Inoltre, avemu identificatu e proteine metaboliche, e proteine ribosomiali è e proteine associate à e cellule cum'è determinanti principali di l'eterogeneità di e fibre musculari scheletriche. Applicendu u nostru flussu di travagliu proteomicu à campioni di pazienti cun miopatia da nematodi, avemu ancu dimustratu chì a tipizzazione di fibre basata nantu à MYH ùn riflette micca cumpletamente l'eterogeneità di u musculu scheletricu, soprattuttu quandu u sistema hè perturbatu. Infatti, indipendentemente da u tipu di fibra basata nantu à MYH, a miopatia da nematodi si traduce in un cambiamentu versu fibre più veloci è menu ossidative.
E fibre musculari scheletriche sò state classificate dapoi u XIX seculu. L'analisi omiche recenti ci anu permessu di cumincià à capisce i profili d'espressione di diversi tipi di fibre MYH è e so risposte à diversi stimuli. Cum'è descrittu quì, l'approcci omichi anu ancu u vantaghju di una maggiore sensibilità per quantificà i marcatori di tipu di fibra chè i metudi tradiziunali basati nantu à l'anticorpi, senza affidà si à a quantificazione di un solu (o uni pochi) marcatori per definisce un tipu di fibra musculare scheletrica. Avemu utilizatu flussi di travagliu trascrittomichi è proteomichi cumplementari è integratu i risultati per esaminà a regulazione trascrizionale è post-trascrizionale di l'eterogeneità di e fibre in e fibre musculari scheletriche umane. Stu flussu di travagliu hà risultatu in a fallimentu di identificà e fibre pure di tipu 2X à u livellu di e proteine in u vastus lateralis di a nostra coorte di ghjovani omi sani. Questu hè coerente cù studii precedenti di fibra unica chì anu trovu <1% di fibre 2X pure in vastus lateralis sanu, ancu se questu duveria esse cunfirmatu in altri musculi in u futuru. A discrepanza trà a rilevazione di fibre 2X quasi pure à u livellu di mRNA è solu fibre 2A/2X miste à u livellu di e proteine hè sconcertante. L'espressione di l'ARNm di l'isoforma MYH ùn hè micca circadiana,67 ciò chì suggerisce chì hè improbabile chì avemu "mancatu" u signale d'iniziu MYH2 in fibre 2X apparentemente pure à u livellu di l'ARN. Una pussibile spiegazione, ancu s'è puramente ipotetica, puderia esse e differenze in a stabilità di e proteine è/o di l'ARNm trà l'isoforme MYH. Infatti, nisuna fibra rapida hè 100% pura per alcuna isoforma MYH, è ùn hè chjaru se i livelli d'espressione di l'ARNm MYH1 in u range 70-90% darebbenu una uguale abbundanza di MYH1 è MYH2 à u livellu di e proteine. Tuttavia, quandu si cunsidereghja tuttu u trascrittoma o proteoma, l'analisi di cluster pò identificà cun fiducia solu dui cluster distinti chì rapprisentanu fibre musculari scheletriche lente è veloci, indipendentemente da a so precisa cumpusizione MYH. Questu hè coerente cù l'analisi chì utilizanu approcci trascrittomici à nucleu unicu, chì tipicamente identificanu solu dui cluster mionucleari distinti. 68, 69, 70 Inoltre, ancu s'è studii proteomichi precedenti anu identificatu fibre di tipu 2X, queste fibre ùn si raggruppanu micca separatamente da u restu di e fibre veloci è mostranu solu un picculu numeru di proteine differentemente abbundanti paragunate à altri tipi di fibre basate nantu à MYH. 14 Questi risultati suggerenu chì duvemu vultà à a visione di u principiu di u XXu seculu di a classificazione di e fibre musculari, chì dividia e fibre musculari scheletriche umane micca in trè classi distinte basate nantu à MYH, ma in dui gruppi basati nantu à e so proprietà metaboliche è contrattili. 63
Più impurtante, l'eterogeneità di e miofibre deve esse cunsiderata longu à parechje dimensioni. Studi "omici" precedenti anu indicatu sta direzzione, suggerendu chì e fibre musculari scheletriche ùn formanu micca gruppi discreti ma sò disposte longu à un continuum. 11, 13, 14, 64, 71 Quì, mostremu chì, in più di e differenze in e proprietà contrattili è metaboliche di u musculu scheletricu, e miofibre ponu esse differenziate da caratteristiche relative à l'interazzione cellula-cellula è i meccanismi di traduzzione. Infatti, avemu trovu eterogeneità di ribosomi in e fibre musculari scheletriche chì cuntribuisce à l'eterogeneità indipendentemente da i tipi di fibre lente è veloci. A causa sottostante di sta sustanziale eterogeneità di miofibre, indipendente da u tipu di fibre lente è veloci, ferma pocu chjara, ma pò indicà una urganizazione spaziale specializata in i fascicoli musculari chì rispondenu in modu ottimale à forze è carichi specifici,72 una cumunicazione cellulare o specifica di l'organu specializata cù altri tipi di cellule in u microambiente musculare73,74,75 o differenze in l'attività di i ribosomi in e singole miofibre. Infatti, l'eteroplasmia ribosomiale, sia per via di a sustituzione paraloga di RPL3 è RPL3L sia à u livellu di a 2'O-metilazione di u rRNA, hè stata dimustrata esse assuciata à l'ipertrofia di u musculu scheletricu76,77. L'applicazioni multiomiche è spaziali cumminate cù a caratterizazione funzionale di e singole miofibre faranu avanzà ulteriormente a nostra comprensione di a biologia musculare à u livellu multiomicu78.
Analizendu i proteomi di miofibre singole di pazienti cun miopatie nemaline, avemu ancu dimustratu l'utilità, l'efficacia è l'applicabilità di a proteomica di miofibre singole per elucidà a fisiopatologia clinica di u musculu scheletricu. Inoltre, paragunendu u nostru flussu di travagliu à l'analisi proteomica globale, simu stati capaci di dimustrà chì a proteomica di miofibre singole produce a stessa prufundità d'infurmazione cum'è a proteomica tissutale globale è estende sta prufundità tenendu contu di l'eterogeneità interfibre è di u tipu di miofibre. In più di e differenze previste (ancu s'è variabili) in u rapportu di u tipu di fibre osservate in e miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1 paragunate à i cuntrolli sani,19 avemu ancu osservatu un rimodellamentu ossidativu è extracellulare indipendente da u cambiamentu di u tipu di fibre mediatu da MYH. A fibrosi hè stata digià signalata in miopatie nemaline TNNT1.19 Tuttavia, a nostra analisi si basa nantu à sta scuperta rivelendu ancu livelli aumentati di proteine legate à u stress secrete extracellulari, cum'è l'annesine, implicate in i meccanismi di riparazione sarcolemmale, in miofibre di pazienti cun miopatie nemaline ACTA1 è TNNT1.57,58,59 In conclusione, i livelli aumentati di annessina in miofibre di pazienti cun miopatia nemaline ponu rapprisintà una risposta cellulare per riparà miofibre gravemente atrofiche.
Ancu s'è questu studiu rapprisenta a più grande analisi di omica musculare sana di una sola fibra umana finu à oghje, ùn hè micca senza limitazioni. Avemu isolatu e fibre musculari scheletriche da un campione relativamente chjucu è omogeneu di participanti è un solu musculu (u vastus lateralis). Dunque, hè impussibile escludere l'esistenza di pupulazioni specifiche di fibre in tutti i tipi di musculi è à l'estremi di a fisiologia musculare. Per esempiu, ùn pudemu micca escludere a pussibilità di un sottoinsieme di fibre ultraveloci (per esempiu, fibre pure 2X) chì emergenu in velocisti altamente allenati è/o atleti di forza79 o durante periodi di inattività musculare66,80. Inoltre, a dimensione limitata di u campione di participanti ci hà impeditu di investigà e differenze sessuali in l'eterogeneità di e fibre, postu chì i rapporti di u tipu di fibre sò cunnisciuti per differisce trà omi è donne. Inoltre, ùn simu stati capaci di realizà analisi trascrittomiche è proteomiche nantu à e stesse fibre musculari o campioni di i stessi participanti. Mentre noi è altri cuntinuemu à ottimizà l'analisi di cellule singole è di miofibre singole utilizendu l'analisi omica per ottene un input di campione ultra bassu (cum'è dimustratu quì in l'analisi di fibre di pazienti cun miopatia mitocondriale), l'uppurtunità di cumminà approcci multi-omici (è funziunali) in fibre musculari singole diventa evidente.
In generale, i nostri dati identificanu è spieganu i fattori trascrizionali è post-trascrizionali di l'eterogeneità di u musculu scheletricu. In particulare, presentemu dati chì sfidanu un dogma di longa data in a fisiologia di u musculu scheletricu assuciatu à a definizione classica di i tipi di fibre basata nantu à MYH. Speremu di rinnuvà u dibattitu è infine di ripensà a nostra comprensione di a classificazione è di l'eterogeneità di e fibre di u musculu scheletricu.
Quattordici participanti caucasici (12 omi è 2 donne) anu accunsentutu vuluntariamente à participà à questu studiu. U studiu hè statu appruvatu da u Cumitatu Eticu di l'Ospedale Universitariu di Ghent (BC-10237), hà rispettatu a Dichjarazione di Helsinki di u 2013, è hè statu registratu in ClinicalTrials.gov (NCT05131555). E caratteristiche generali di i participanti sò presentate in a Tabella Supplementare 1. Dopu avè ottenutu u cunsensu infurmatu verbale è scrittu, i participanti sò stati sottumessi à un esame medicu prima di l'inclusione finale in u studiu. I participanti eranu ghjovani (22-42 anni), sani (senza cundizioni mediche, senza storia di fumà) è moderatamente attivi fisicamente. L'assunzione massima di ossigenu hè stata determinata aduprendu un ergometru à gradini per valutà a forma fisica cum'è descrittu prima. 81
I campioni di biopsia musculare sò stati raccolti à riposu è à digiunu trè volte, à 14 ghjorni di distanza. Siccomu sti campioni sò stati raccolti cum'è parte di un studiu più grande, i participanti anu cunsumatu placebo (lattosiu), un antagonista di i recettori H1 (540 mg di fexofenadina), o un antagonista di i recettori H2 (40 mg di famotidina) 40 minuti prima di a biopsia. Avemu dimustratu prima chì sti antagonisti di i recettori di l'istamina ùn influenzanu micca a forma fisica di u musculu scheletricu à riposu81, è ùn hè stata osservata alcuna raggruppazione ligata à u statu in i nostri grafici di cuntrollu di qualità (Figure supplementari 3 è 6). Una dieta standardizata (41,4 kcal/kg di pesu corpu, 5,1 g/kg di carboidrati di pesu corpu, 1,4 g/kg di proteine di pesu corpu è 1,6 g/kg di grassu di pesu corpu) hè stata mantenuta per 48 ore prima di ogni ghjornu sperimentale, è una colazione standardizata (1,5 g/kg di carboidrati di pesu corpu) hè stata cunsumata a mattina di u ghjornu sperimentale. Sottu anestesia lucale (0,5 ml di lidocaina à 1% senza epinefrina), e biopsie musculari sò state ottenute da u musculu vastus lateralis aduprendu l'aspirazione percutanea di Bergström.82 I campioni musculari sò stati immediatamente inclusi in RNAlater è conservati à 4 ° C finu à a dissezione manuale di e fibre (finu à 3 ghjorni).
I fasci di miofibre appena isolati sò stati trasferiti in un mezu RNAlater frescu in una piastra di cultura. E miofibre individuali sò state poi dissezionate manualmente cù un stereomicroscopiu è pinzette fini. Venticinque fibre sò state dissezionate da ogni biopsia, prestandu una attenzione particulare à a selezzione di e fibre da diverse zone di a biopsia. Dopu a dissezione, ogni fibra hè stata immersa delicatamente in 3 μl di buffer di lisi (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) chì cuntene enzimi proteinasi K è DNasi per rimuovere e proteine è u DNA indesiderati. A lisi cellulare è a rimozione di proteine/DNA sò state poi iniziate da un breve vortex, centrifugazione di u liquidu in una microcentrifuga è incubazione à temperatura ambiente (10 min). U lisatu hè statu poi incubatu in un termociclatore (T100, Bio-Rad) à 37°C per 5 min, 75°C per 5 min, è poi immediatamente conservatu à -80°C finu à ulteriore trasfurmazione.
E biblioteche di RNA poliadenilatu cumpatibili cù Illumina sò state preparate da 2 µl di lisatu di miofibre utilizendu u QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). I metudi dettagliati ponu esse truvati in u manuale di u fabricatore. U prucessu principia cù a sintesi di cDNA di primu filamentu per trascrizione inversa, durante a quale sò introdutti identificatori moleculari unichi (UMI) è codici à barre i1 specifichi di u campione per assicurà u raggruppamentu di i campioni è riduce a variabilità tecnica durante u processu à valle. U cDNA di 96 miofibre hè tandu raggruppatu è purificatu cù perle magnetiche, dopu à chì l'RNA hè eliminatu è a sintesi di u secondu filamentu hè realizata utilizendu primer aleatorii. A biblioteca hè purificata cù perle magnetiche, sò aghjunti tag i5/i7 specifichi di u pool è amplificatu per PCR. Un passu finale di purificazione produce biblioteche cumpatibili cù Illumina. A qualità di ogni pool di biblioteca hè stata valutata utilizendu u Kit di Analisi di DNA per Piccoli Frammenti ad Alta Sensibilità (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Basatu annantu à a quantificazione di Qubit, i gruppi sò stati ulteriormente raggruppati à cuncentrazioni equimolari (2 nM). U gruppu risultante hè statu dopu sequenziatu annantu à un strumentu NovaSeq 6000 in modu standard utilizendu u Kit di Reagenti NovaSeq S2 (1 × 100 nucleotidi) cù una carica di 2 nM (4% PhiX).
A nostra pipeline hè basata annantu à a pipeline d'analisi di dati QuantSeq Pool di Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). I dati sò stati prima demultiplexati cù bcl2fastq2 (v2.20.0) basatu annantu à l'indice i7/i5. A lettura 2 hè stata dopu demultiplexata cù idemux (v0.1.6) basatu annantu à u codice à barre di u campione i1 è e sequenze UMI sò state estratte cù umi_tools (v1.0.1). E letture sò state dopu tagliate cù cutadapt (v3.4) in parechji round per rimuovere letture corte (<20 in lunghezza) o letture custituite solu da sequenze adattatrici. E letture sò state dopu allineate à u genomu umanu utilizendu STAR (v2.6.0c) è i fugliali BAM sò stati indicizzati cù SAMtools (v1.11). E letture duplicate sò state eliminate utilizendu umi_tools (v1.0.1). Infine, u conteggio di l'allineamentu hè statu effettuatu utilizendu featureCounts in Subread (v2.0.3). U cuntrollu di qualità hè statu realizatu cù FastQC (v0.11.9) in parechje tappe intermedie di u pipeline.
Tutti l'ulteriori trattamenti è visualizazioni bioinformatiche sò stati realizati in R (v4.2.3), principalmente utilizendu u flussu di travagliu Seurat (v4.4.0). 83 Dunque, i valori UMI individuali è e matrici di metadati sò stati trasformati in oggetti Seurat. I geni espressi in menu di u 30% di tutte e fibre sò stati rimossi. I campioni di bassa qualità sò stati rimossi in basa à una soglia minima di 1000 valori UMI è 1000 geni rilevati. Infine, 925 fibre anu passatu tutti i passi di filtraggio di cuntrollu di qualità. I valori UMI sò stati nurmalizati utilizendu u metudu Seurat SCTransform v2, 84 cumprese tutte e 7418 caratteristiche rilevate, è e differenze trà i participanti sò state regresse. Tutti i metadati pertinenti ponu esse truvati in u Dataset Supplementare 28.
Data di publicazione: 10 settembre 2025