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U stabilimentu di mudelli animali di cambiamentu modicu (MC) hè una basa impurtante per studià MC. Cinquanta-quattru cunigli bianchi neozelandesi sò stati divisi in u gruppu di operazione simulata, u gruppu di implantazione musculare (gruppu ME) è u gruppu di implantazione di nucleus pulposus (gruppu NPE). In u gruppu NPE, u discu intervertebrali hè stata esposta da l'approcciu kirurggicu lumbar anterolaterale è una agulla hè stata aduprata per punisce u corpu vertebrali L5 vicinu à a placa finale. NP hè stata estratta da u discu intervertebrale L1 / 2 da una siringa è injected in questu. Perforà un pirtusu in l'ossu subcondrale. I prucedure chirurgiche è i metudi di perforazione in u gruppu di implantazione musculare è u gruppu di operazione simulata eranu listessi in u gruppu di implantazione NP. In u gruppu ME, un pezzu di musculu hè statu postu in u pirtusu, mentre chì in u gruppu di sham-operation, nunda hè stata postu in u burcu. Dopu l'operazione, a scanning MRI è e teste biologiche moleculari sò state realizate. U signale in u gruppu NPE hà cambiatu, ma ùn ci era micca un cambiamentu di signale evidenti in u gruppu sham-operation è u gruppu ME. L'osservazione histologica hà dimustratu chì a proliferazione di tissuti anormali hè stata osservata in u situ di implantazione, è l'espressione di IL-4, IL-17 è IFN-γ hè stata aumentata in u gruppu NPE. L'implantazione di NP in l'ossu subcondrale pò furmà un mudellu animali di MC.
I cambiamenti modici (MC) sò lesioni di i platti vertebrali è a medula ossea adiacente visibili nantu à l'imaghjini di resonance magnetica (MRI). Sò abbastanza cumuni in individui cù sintomi associati1. Parechji studii anu enfatizatu l'impurtanza di MC per via di a so associazione cù u lumbaru (LBP) 2,3. de Roos et al.4 è Modic et al.5 indipindentamente prima descrizanu trè tippi diffirenti di anormalità di signali subchondral in a medula vertebrali. I cambiamenti di tipu I modi sò ipointensi nantu à sequenze ponderate T1 (T1W) è iperintensi in sequenze ponderate T2 (T2W). Questa lesione palesa fissure endplates è tissutu di granulazione vascular adiacente in a medula ossea. I cambiamenti di u tipu Modic II mostranu un signalu altu nantu à e sequenze T1W è T2W. In stu tipu di lesione, si pò truvà a distruzzione di l'endplate, è ancu a sustituzione di grassu histologicu di a medula ossea adiacente. I cambiamenti di u tipu Modic III mostranu un signalu bassu in sequenze T1W è T2W. E lesioni sclerotiche chì currispondenu à i platti terminali sò state osservate6. MC hè cunsideratu una malatia patologica di a spina è hè assuciata strettamente cù parechje malatie degenerative di a spina7,8,9.
In cunsiderà i dati dispunibuli, parechji studii anu furnitu insights detallati in l'etiologia è i miccanismi patologichi di MC. Albert et al. suggerì chì MC pò esse causatu da l'hernia di discu8. Hu et al. attribuitu MC à una degenerazione severa di u discu10. Kroc hà prupostu u cuncettu di "rupture di discu internu", chì dice chì u traumu di discu ripetitivu pò purtà à microtears in u endplate. Dopu a furmazione di cleft, a distruzzione di l'endplate da u nucleus pulposus (NP) pò attivà una risposta autoimmune, chì porta ancu à u sviluppu di MC11. Ma et al. hà spartutu una vista simili è hà dettu chì l'autoimmunità indotta da NP ghjoca un rolu chjave in a patogenesi di MC12.
E cellule di u sistema immune, in particulare i linfociti CD4+ T helper, ghjucanu un rolu criticu in a patogenesi di l'autoimmunità13. U subset Th17 recentemente scupertu produce a citochina proinflamatoria IL-17, prumove l'espressione di chemokine, è stimula i cellule T in l'organi danati per pruduce IFN-γ14. I celluli Th2 ghjucanu ancu un rolu unicu in a patogenesi di risposti immune. L'espressione di IL-4 cum'è una cellula Th2 rappresentativa pò purtà à cunsequenze immunopatologiche gravi15.
Ancu s'è parechji studii clinichi sò stati realizati nantu à MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, ci hè sempre una mancanza di mudelli sperimentali animali adattati chì ponu imite u prucessu MC chì spessu si trova in l'omu è pò esse. utilizatu per investigà l'etiologia o novi trattamenti cum'è a terapia mirata. A data, solu uni pochi di mudelli animali di MC sò stati signalati per studià i miccanismi patologichi sottostanti.
Basatu nantu à a teoria autoimmune pruposta da Albert è Ma, stu studiu hà stabilitu un mudellu MC di cunigliu simplice è riproducibile da l'autotransplanting NP vicinu à a piastra finale vertebrali perforata. Altri ugettivi sò di osservà e caratteristiche istologiche di i mudelli animali è evaluà i miccanismi specifichi di NP in u sviluppu di MC. Per questu scopu, usemu tecniche cum'è a biologia molekulari, MRI è studii istologichi per studià a progressione di MC.
Dui cunigli sò morti di sanguinamentu durante a cirurgia, è quattru cunigli sò morti durante l'anestesia durante a MRI. I restanti 48 conigli anu sopravvissutu è ùn anu micca mostratu segni cumportamentali o neurologichi dopu a cirurgia.
A MRI mostra chì l'intensità di u signale di u tissutu incrustatu in diversi buchi hè diversu. L'intensità di u signale di u corpu vertebrali L5 in u gruppu NPE hà cambiatu gradualmente à 12, 16 è 20 simane dopu l'inserimentu (a sequenza T1W dimustrava un signalu bassu, è a sequenza T2W mostrava un signalu mistu più un signalu bassu) (Fig. 1C), mentri l'apparizioni MRI. di l'altri dui gruppi di parti incrustati sò stati relativamente stabile durante u stessu periodu (Fig. 1A, B).
(A) MRI sequenziali rapprisentanti di a spina lumbar di cunigliu in 3 punti di tempu. Nisuna anormalità di signale hè stata trovata in l'imaghjini di u gruppu di operazione sham. (B) E caratteristiche di u signale di u corpu vertebrali in u gruppu ME sò simili à quelli in u gruppu di sham-operation, è ùn hè micca osservatu un cambiamentu di signale significativu in u situ di incrustazione cù u tempu. (C) In u gruppu NPE, u signalu bassu hè chjaramente visibile in a sequenza T1W, è u signale mischju è u signale bassu sò chjaramente visibili in a sequenza T2W. Da u periodu di 12 settimane à u periodu di 20 settimane, i signali alti sporadici chì circundanu i signali bassi in a sequenza T2W diminuiscenu.
L'iperplasia di l'ossu evidenti pò esse vistu in u situ di l'implantazione di u corpu vertebrali in u gruppu NPE, è l'iperplasia di l'osse si trova più veloce da 12 à 20 sette (Fig. 2C) cumparatu cù u gruppu NPE, ùn hè micca osservatu un cambiamentu significativu in u modellu vertebrali. corpi; Sham group è ME group (Fig. 2C) 2A,B).
(A) A superficia di u corpu vertebrali à a parte implantata hè assai liscia, u pirtusu guarisce bè, è ùn ci hè micca hyperplasia in u corpu vertebrali. (B) A forma di u situ implantatu in u gruppu ME hè simile à quellu in u gruppu di operazione sham, è ùn ci hè micca un cambiamentu evidenti in l'apparenza di u situ implantatu cù u tempu. (C) L'iperplasia di l'osse hè stata in u situ implantatu in u gruppu NPE. L'iperplasia di l'osse hà aumentatu rapidamente è ancu allargatu à traversu u discu intervertebrali à u corpu vertebrali contralateral.
L'analisi istologica furnisce infurmazioni più dettagliate nantu à a furmazione di l'osse. A Figura 3 mostra i ritratti di e sezioni postoperatorie macchiate cù H&E. In u gruppu di sham-operation, i chondrocytes sò stati ben disposti è nisuna proliferazione cellulare hè stata rilevata (Fig. 3A). A situazione in u gruppu ME era simile à quella in u gruppu di operazione sham (Fig. 3B). In ogni casu, in u gruppu NPE, un gran numaru di chondrocytes è a proliferazione di celluli NP-like sò stati osservati in u situ di implantazione (Fig. 3C);
(A) Trabeculae pò esse vistu vicinu à a piastra finale, i chondrocytes sò disposti bè cù una dimensione è forma di cellula uniforme è senza proliferazione (40 volte). (B) A cundizione di u situ di implantazione in u gruppu ME hè simile à quella di u gruppu sham. Trabeculae è chondrocytes ponu esse vistu, ma ùn ci hè micca una proliferazione evidenti à u situ di implantazione (40 volte). (B) Pò esse vistu chì i condrociti è i celluli NP-like proliferate significativamente, è a forma è a dimensione di i chondrocytes sò irregolari (40 volte).
L'espressione di l'ARNm di l'interleuchina 4 (IL-4), l'ARNm di l'interleuchina 17 (IL-17) è l'ARNm di l'interferon γ (IFN-γ) sò stati osservati in i dui gruppi NPE è ME. Quandu i livelli di spressione di i geni di destinazione sò stati paragunati, l'espressioni di u genu di IL-4, IL-17 è IFN-γ anu aumentatu significativamente in u gruppu NPE cumparatu cù quelli di u gruppu ME è u gruppu di operazione sham (Fig. 4). (P < 0,05). Comparatu cù u gruppu di operazione simulata, i livelli di espressione di IL-4, IL-17 è IFN-γ in u gruppu ME anu aumentatu solu ligeramente è ùn anu micca righjuntu u cambiamentu statisticu (P> 0.05).
L'espressione di mRNA di IL-4, IL-17 è IFN-γ in u gruppu NPE hà dimustratu una tendenza significativamente più altu ch'è quelli in u gruppu di operazione simulata è u gruppu ME (P <0.05).
In cuntrastu, i livelli di espressione in u gruppu ME ùn anu mostratu nisuna differenza significativa (P>0.05).
L'analisi Western blot hè stata realizata utilizendu anticorpi dispunibili in u cummerciu contr'à IL-4 è IL-17 per cunfirmà u mudellu d'espressione mRNA alteratu. Cum'è mostra in Figure 5A,B, cumparatu cù u gruppu ME è u gruppu di operazione sham, i livelli di prutezione di IL-4 è IL-17 in u gruppu NPE anu aumentatu significativamente (P <0.05). In cunfrontu cù u gruppu di operazione sham, i livelli di prutezione di IL-4 è IL-17 in u gruppu ME ùn anu ancu riesciutu à alcuni cambiamenti statisticamente significativi (P> 0.05).
(A) I livelli di prutezione di IL-4 è IL-17 in u gruppu NPE eranu significativamente più altu ch'è quelli in u gruppu ME è u gruppu placebo (P <0.05). (B) Histogramma Western blot.
A causa di u numeru limitatu di mostri umani ottenuti durante a cirurgia, studii chjaru è detallati nantu à a patogenesi di MC sò un pocu difficili. Avemu pruvatu à stabilisce un mudellu animale di MC per studià i so miccanismi patologichi potenziali. À u listessu tempu, a valutazione radiologica, a valutazione istologica è a valutazione biologica moleculare sò stati utilizati per seguità u cursu di MC induce da NP autograft. In u risultatu, u mudellu di implantazione NP hà risultatu in un cambiamentu graduali in l'intensità di u signale da 12 settimane à 20 settimane di punti di tempu (signale bassu mistu in sequenze T1W è signale bassu in sequenze T2W), chì indicanu cambiamenti di tissuti, è l'histologicu è moleculare. valutazioni biologiche cunfirmatu i risultati di u studiu radiologicu.
I risultati di stu esperimentu mostranu chì i cambiamenti visuali è histologici sò accaduti in u situ di a violazione di u corpu vertebrali in u gruppu NPE. In u stessu tempu, l'espressione di i geni IL-4, IL-17 è IFN-γ, è ancu di IL-4, IL-17 è IFN-γ sò stati osservati, chì indicanu chì a violazione di u tissutu di nucleus pulposus autologue in a vertebra. corpu pò causà una seria di signali è cambiamenti morfologichi. Hè facilitu truvà chì e caratteristiche di u signale di i corpi vertebrali di u mudellu animali (signale bassu in a sequenza T1W, signale mistu è signale bassu in a sequenza T2W) sò assai simili à quelli di e cellule vertebrali umane, è e caratteristiche MRI ancu. cunfirmà l'osservazioni di l'histologia è l'anatomia grossa, vale à dì, i cambiamenti in e cellule di u corpu vertebrali sò prugressivi. Ancu s'è a risposta inflamatoria causata da un traumu agutu pò apparisce subitu dopu à a puntura, i risultati di MRI anu dimustratu chì i cambiamenti di signale chì aumentanu progressivamente apparsu 12 settimane dopu à a puntura è persistenu finu à 20 sette senza alcun segnu di ricuperazione o inversione di cambiamenti MRI. Questi risultati suggerenu chì a NP vertebrali autologa hè un metudu affidabile per stabilisce MV progressiva in i cunigli.
Stu mudellu di puntura precisa cumpetenza, tempu è sforzu chirurgicu adattatu. In esperimenti preliminari, dissection o stimulazione eccessiva di e strutture ligamentous paravertebrali pò esse risultatu in a furmazione di osteophytes vertebrali. Si deve esse attentu à ùn dannu o irritate i dischi adiacenti. Siccomu a prufundità di penetrazione deve esse cuntrullata per ottene risultati consistenti è riproducibili, avemu fattu manualmente un tappu tagliendu a guaina di una agulla longa di 3 mm. Utilizà stu tappu assicura una prufundità di perforazione uniforme in u corpu vertebrali. In esperimenti preliminari, trè chirurghi ortopedici implicati in l'operazione anu truvatu agulla di calibre 16 più faciule per travaglià cù agulla di calibre 18 o altri metudi. Per evitari un sanguinamentu eccessivu durante a perforazione, mantene l'agulla fermu per un pezzu di tempu furnisce un pirtusu d'inserzione più adattatu, chì suggerenu chì un certu gradu di MC pò esse cuntrullatu in questu modu.
Ancu s'ellu parechji studii anu miratu à MC, pocu hè cunnisciutu di l'etiologia è a patogenesi di MC25,26,27. Basatu nantu à i nostri studii previ, avemu trovu chì l'autoimmunità ghjoca un rolu chjave in l'occurrence è u sviluppu di MC12. Stu studiu hà esaminatu l'espressione quantitativa di IL-4, IL-17, è IFN-γ, chì sò i principali camini di differenziazione di e cellule CD4 + dopu stimulazione di l'antigenu. In u nostru studiu, cumparatu cù u gruppu negativu, u gruppu NPE hà avutu una espressione più altu di IL-4, IL-17 è IFN-γ, è i livelli di prutezione di IL-4 è IL-17 eranu ancu più altu.
Clinicamente, l'espressione di mRNA di IL-17 hè aumentata in e cellule NP da i pazienti cun hernia di discu28. L'aumentu di i livelli d'espressione di IL-4 è IFN-γ sò stati ancu truvati in un mudellu di hernia di discu aguda non cumpressiva cumparatu cù cuntrolli sani29. L'IL-17 ghjoca un rolu chjave in a inflamazioni, a ferita tissutale in e malatie autoimmune30 è aumenta a risposta immune à l'IFN-γ31. Una ferita tissutale mediata da IL-17 hè stata rappurtata in i topi MRL/lpr32 è i topi suscettibili à l'autoimmunità33. L'IL-4 pò inibisce l'espressione di citochine proinflamatorii (cum'è IL-1β è TNFα) è l'attivazione di macrophage34. Hè statu infurmatu chì l'espressione di mRNA di IL-4 era diversa in u gruppu NPE cumparatu cù IL-17 è IFN-γ à u stessu tempu; L'espressione di mRNA di IFN-γ in u gruppu NPE era significativamente più altu ch'è in l'altri gruppi. Dunque, a produzzione di IFN-γ pò esse un mediatore di a risposta inflammatoria indotta da l'intercalazione NP. I studii anu dimustratu chì l'IFN-γ hè pruduciutu da parechji tippi di cellule, cumprese cellule T helper attivate di u tipu 1, cellule naturali killer, è macrophages35,36, è hè una citochina proinflamatoria chjave chì prumove a risposta immune37.
Stu studiu suggerisce chì a risposta autoimmune pò esse implicata in l'occurrence è u sviluppu di MC. Luoma et al. truvò chì e caratteristiche di u signale di MC è NP prominente sò simili nantu à MRI, è tutti dui mostranu un signalu altu in a sequenza T2W38. Certi citochine sò stati cunfirmati per esse assuciati strettamente cù l'occurrence di MC, cum'è IL-139. Ma et al. suggerì chì a protrusione ascendente o discendente di NP pò avè una grande influenza nantu à l'occurrence è u sviluppu di MC12. Bobechko40 è Herzbein et al.41 anu infurmatu chì NP hè un tissutu immunotolerante chì ùn pò micca entre in a circulazione vascular da a nascita. I protrusioni di NP introducenu corpi stranieri in u fornimentu di sangue, mediandu cusì reazzioni autoimmune lucali42. E reazzioni autoimmune ponu induce un gran numaru di fatturi immune, è quandu questi fattori sò continuamente esposti à i tessuti, ponu causà cambiamenti in signaling43. In questu studiu, a sovraespressione di IL-4, IL-17 è IFN-γ sò fattori immune tipici, chì pruvucanu ancu a stretta relazione trà NP è MCs44. Stu mudellu di l'animali imita bè a scuperta NP è l'entrata in a piastra finale. Stu prucessu hà ancu revelatu l'impattu di l'autoimmunità nantu à MC.
Comu s'aspittava, stu mudellu d'animali ci furnisce una piattaforma pussibuli per studià MC. Tuttavia, stu mudellu hà ancu alcune limitazioni: prima, durante a fase d'osservazione di l'animali, certi cunigli in u stadiu intermediu anu da esse eutanasiati per a prova istologica è di biologia moleculare, cusì certi animali "fallu fora di usu" cù u tempu. Siconda, anche se trè punti di tempu sò stati stabiliti in stu studiu, sfurtunatamenti, avemu modellatu solu un tipu di MC (Modic type I change), per quessa, ùn hè micca abbastanza per rapprisintà u prucessu di sviluppu di a malatia umana, è più punti di tempu deve esse stabilitu à megliu osservà tutti i cambiamenti di signale. In terzu, i cambiamenti in a struttura di tissuti ponu esse chjaramente dimustrati da a tintura istologica, ma alcune tecniche specializate ponu revelà megliu i cambiamenti microstrutturali in stu mudellu. Per esempiu, a microscopia di luce polarizzata hè stata aduprata per analizà a furmazione di fibrocartilage in dischi intervertebrali di cunigliu45. L'effetti à longu andà di NP nantu à MC è endplate necessitanu più studiu.
Cinquanta-quattru cuniglii bianchi maschili di Nova Zelanda (pesu circa 2,5-3 kg, età 3-3,5 mesi) sò stati divisi aleatoriamente in u gruppu di operazione sham, u gruppu di implantazione musculare (gruppu ME) è u gruppu di implantazione di radici nervose (gruppu NPE). Tutte e prucedure sperimentali sò stati appruvati da u Cumitatu Eticu di l'Hospital di Tianjin, è i metudi sperimentali sò stati realizati in stretta cunfurmità cù e linee appruvate.
Certi miglii sò stati fatti à a tecnica kirurgia di S. Sobajima 46 . Ogni cunigliu hè stata postu in una pusizioni di reclinazione laterale è a superficia anteriore di cinque dischi intervertebrali lumbar consecutivi (IVD) hè stata esposta cù un approcciu retroperitoneale posterolaterale. Ogni cunigliu hè stata anestesia generale (20% urethane, 5 ml / kg via a vena di l'orechja). Una incisione longitudinale di a pelle hè stata fatta da u bordu inferjuri di i costi à a pelvic brim, 2 cm ventral à i musculi paravertebrali. A spina anterolateral right da L1 à L6 hè stata esposta da a dissection sharp and blunt of the overlying subcutaneous tissue, retroperitoneal tissue, and muscles (Fig. 6A). U nivellu di discu hè statu determinatu utilizendu a pelvic brim cum'è un puntu di riferimentu anatomicu per u nivellu di discu L5-L6. Aduprate una agulla di puntura 16-gauge per perforà un pirtusu vicinu à a piastra finale di a vertebra L5 à una prufundità di 3 mm (Fig. 6B). Aduprate una siringa 5-ml per aspirate u nucleus pulposus autologous in u discu intervertebrali L1-L2 (Fig. 6C). Eliminate u nucleus pulposus o musculu secondu i bisogni di ogni gruppu. Dopu chì u foru di perforazione hè prufunditu, i suturi assorbabili sò posti nantu à a fascia prufonda, a fascia superficiale è a pelle, tenendu cura di ùn dannà u tessulu periostale di u corpu vertebrali durante a cirurgia.
(A) U discu L5-L6 hè espostu via un approcciu retroperitoneale posterolaterale. (B) Aduprate una agulla di calibre 16 per perforà un pirtusu vicinu à l'endplate L5. (C) I MF autologi sò colti.
L'anesthesia generale hè stata amministrata cù 20% urethane (5 ml / kg) amministratu per via di a vena di l'orechja, è e radiografia di a spina lumbar sò state ripetute à 12, 16 è 20 settimane postoperatori.
I cunigli sò sacrificati per iniezione intramusculare di ketamina (25,0 mg / kg) è pentobarbital di sodiu intravenosa (1,2 g / kg) à 12, 16 è 20 settimane dopu a cirurgia. A spina sana hè stata eliminata per l'analisi histologica è l'analisi vera hè stata realizata. Trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) è Western blotting sò stati usati per detectà cambiamenti in i fatturi immune.
L'esami MRI sò stati realizati in cunigli cù un magnetu clinicu 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) equipatu di un ricevitore di bobina ortogonale. I cunigli sò stati anestetizzati cù 20% urethane (5 mL / kg) per via di a vena di l'orechja, è poi posti in supina in u magnetu cù a regione lumbar centrata nantu à una bobina di superficia circular di 5 inch di diametru (GE Medical Systems). L'imaghjini di localizatore coronale T2-weighted (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) sò stati acquistati per definisce u locu di u discu lumbar da L3-L4 à L5-L6. Sagittal plane T2-weighted slices sò stati acquistati cù i seguenti paràmetri: sequenza spin-echo veloce cù un tempu di ripetizione (TR) di 2200 ms è un tempu di eco (TE) di 70 ms, matrice; campu visuale di 260 è ottu stimuli; U gruixu di cutting era 2 mm, u gap era 0,2 mm.
Dopu chì l'ultima fotografia hè stata presa è l'ultimu cunigliu hè statu uccisu, i dischi sham, musculu-incrustati è NP sò stati eliminati per l'esame histologicu. I tissuti sò stati fissi in formalin buffered neutru 10% per 1 settimana, decalcified with ethylenediaminetetraacetic acid, and paraffin sectioned. I blocchi di tissuti sò stati incrustati in paraffina è tagliati in sezioni sagittali (5 μm di spessore) cù un microtomu. E sezioni sò state macchiate cù ematossilina è eosina (H&E).
Dopu à cullà i dischi intervertebrali da i cunigli in ogni gruppu, l'RNA tutale hè stata estratta cù una colonna UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) secondu l'istruzzioni di u fabricatore è un sistema di trascrizione inversa ImProm II (Promega Inc. , Madison, WI, USA). A trascrizione inversa hè stata fatta.
RT-qPCR hè stata realizata cù un Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) è SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. U volume di reazione PCR era 20 μl è cuntene 1,5 μl di cDNA diluitu è 0,2 μM di ogni primer. I primers sò stati disignati da OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) è fabbricati da Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Cina) (Table 1). E seguenti cundizioni di ciculu termale sò state aduprate: passu iniziale di attivazione di polimerasi à 94 ° C per 2 min, dopu 40 cicli di 15 s ognunu à 94 ° C per a denaturazione di u mudellu, annealing per 1 min à 60 ° C, estensione è fluorescenza. e misurazioni sò state realizate per 1 min à 72 ° C. Tutti i campioni sò stati amplificati trè volte è u valore mediu hè stata utilizata per l'analisi RT-qPCR. I dati di amplificazione sò stati analizati cù FlexStation 3 (Dispositivi Moleculari, Sunnyvale, CA, USA). L'espressione genica di IL-4, IL-17 è IFN-γ hè stata normalizzata à u cuntrollu endogenu (ACTB). I livelli di espressione relative di mRNA target sò stati calculati cù u metudu 2-ΔΔCT.
A proteina tutale hè stata estratta da i tessuti utilizendu un omogenizatore di tissuti in un buffer di lisi RIPA (contene un cocktail di inibitori di proteasi è fosfatasi) è poi centrifugatu à 13,000 rpm per 20 min à 4 ° C per sguassà i detriti di tissuti. Cinquanta microgrammi di proteina sò stati caricati per via, siparati da 10% SDS-PAGE, è dopu trasferiti à una membrana PVDF. U bloccu hè statu realizatu in 5% di latte seccu senza grassu in Tris-buffered saline (TBS) chì cuntene 0,1% Tween 20 per 1 h à a temperatura di l'ambienti. A membrana hè stata incubata cù l'anticorpu primariu di cunigliu anti-decorin (diluted 1: 200; Boster, Wuhan, China) (diluted 1: 200; Bioss, Beijing, China) per a notte à 4 ° C è hà reagitu in i secondi ghjorni; cù l'anticorpu secundariu (immunoglobulina G di capra anti-rabbit à 1: 40 000 dilution) cumminata cù perossidasi di rafanu (Boster, Wuhan, China) per 1 ora à a temperatura di l'ambienti. I signali di u Western blot sò stati rilevati da una chemiluminescenza aumentata nantu à a membrana chimiluminescente dopu l'irradiazione di raghji X. Per l'analisi densitometrica, i blots sò stati scannati è quantificati cù u software BandScan è i risultati sò stati spressi cum'è u rapportu di l'immunoreattività di u gene di destinazione à l'immunoreattività di tubulina.
I calculi statistichi sò stati realizati cù u pacchettu di software SPSS16.0 (SPSS, USA). I dati raccolti durante u studiu sò stati spressi cum'è media ± deviazione standard (media ± SD) è analizati cù l'analisi di varianza di misure ripetute unidirezionali (ANOVA) per determinà e differenze trà i dui gruppi. P < 0,05 hè statu cunsideratu statisticamente significativu.
Cusì, u stabilimentu di un mudellu animale di MC impiantendu NP autologi in u corpu vertebrali è eseguisce l'osservazione macroanatomica, l'analisi MRI, l'evaluazione istologica è l'analisi biologica moleculare pò diventà un strumentu impurtante per valutà è capisce i miccanismi di MC umanu è sviluppà novi terapii. intervenzioni.
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Tempu di Postu: Dec-13-2024