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A creazione di mudelli animali di cambiamentu modicu (MC) hè una basa impurtante per u studiu di MC. Cinquantaquattru cunigli bianchi di Nova Zelanda sò stati divisi in gruppu di operazione simulata, gruppu di impiantazione musculare (gruppu ME) è gruppu di impiantazione di nucleu pulposu (gruppu NPE). In u gruppu NPE, u discu intervertebrale hè statu espostu per approcciu chirurgicu lombare anterolaterale è un agulla hè stata aduprata per perforà u corpu vertebrale L5 vicinu à a piastra terminale. NP hè stata estratta da u discu intervertebrale L1/2 da una siringa è iniettata in questu. Perforazione di un foru in l'ossu subcondrale. E procedure chirurgiche è i metudi di perforazione in u gruppu di impiantazione musculare è in u gruppu di operazione simulata eranu listessi à quelli in u gruppu di impiantazione NP. In u gruppu ME, un pezzu di musculu hè statu piazzatu in u foru, mentre chì in u gruppu di operazione simulata, nunda hè statu piazzatu in u foru. Dopu l'operazione, sò state realizate scansioni MRI è testi biologichi moleculari. U signale in u gruppu NPE hè cambiatu, ma ùn ci hè statu alcun cambiamentu di signale evidente in u gruppu di operazione simulata è in u gruppu ME. L'osservazione istologica hà dimustratu chì una proliferazione tissutale anormale hè stata osservata in u situ di l'impiantu, è l'espressione di IL-4, IL-17 è IFN-γ hè stata aumentata in u gruppu NPE. L'impiantu di NP in l'ossu subcondrale pò furmà un mudellu animale di MC.
I cambiamenti modichi (MC) sò lesioni di e placche terminali vertebrali è di u midullu osseu adiacente visibili nantu à l'imaghjini di risonanza magnetica (MRI). Sò abbastanza cumuni in l'individui cù sintomi assuciati1. Parechji studii anu enfatizatu l'impurtanza di u MC per via di a so associazione cù u dolore lombare (DSL)2,3. de Roos et al.4 è Modic et al.5 anu descrittu indipindentamente per a prima volta trè tippi diversi di anomalie di u signale subcondrale in u midullu osseu vertebrale. I cambiamenti modichi di tipu I sò ipointensi nantu à e sequenze ponderate in T1 (T1W) è iperintensi nantu à e sequenze ponderate in T2 (T2W). Sta lesione revela placche terminali di fissure è tissutu di granulazione vasculare adiacente in u midullu osseu. I cambiamenti modichi di tipu II mostranu un signale altu nantu à e sequenze T1W è T2W. In questu tipu di lesione, si pò truvà a distruzzione di e placche terminali, è ancu a sustituzione grassa istologica di u midullu osseu adiacente. I cambiamenti modichi di tipu III mostranu un signale bassu in e sequenze T1W è T2W. Sò state osservate lesioni sclerotiche currispondenti à e placche terminali6. A MC hè cunsiderata una malatia patologica di a spina dorsale è hè strettamente assuciata à parechje malatie degenerative di a spina dorsale7,8,9.
Cunsiderendu i dati dispunibili, parechji studii anu furnitu insights dettagliati nantu à l'etiologia è i miccanismi patologichi di MC. Albert et al. anu suggeritu chì MC puderia esse causata da ernia di u discu8. Hu et al. anu attribuitu MC à una degenerazione severa di u discu10. Kroc hà prupostu u cuncettu di "rottura interna di u discu", chì afferma chì i traumi ripetitivi di u discu ponu purtà à microlacerazioni in a placca terminale. Dopu a furmazione di fessure, a distruzzione di a placca terminale da u nucleu pulposu (NP) pò scatenà una risposta autoimmune, chì porta ancu di più à u sviluppu di MC11. Ma et al. anu spartutu una visione simile è anu riportatu chì l'autoimmunità indotta da NP ghjoca un rolu chjave in a patogenesi di MC12.
E cellule di u sistema immunitariu, in particulare i linfociti T helper CD4+, ghjocanu un rolu cruciale in a patogenesi di l'autoimmunità13. U sottogruppu Th17 scupertu di pocu produce a citochina proinfiammatoria IL-17, prumove l'espressione di chemochine è stimula e cellule T in l'organi danneggiati à pruduce IFN-γ14. E cellule Th2 ghjocanu ancu un rolu unicu in a patogenesi di e risposte immunitarie. L'espressione di IL-4 cum'è una cellula Th2 rappresentativa pò purtà à gravi cunsequenze immunopatologiche15.
Ancu s'è parechji studii clinichi sò stati realizati nantu à MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, ci hè sempre una mancanza di mudelli sperimentali animali adatti chì ponu imità u prucessu MC chì si verifica spessu in l'omu è ponu esse aduprati per investigà l'etiologia o novi trattamenti cum'è a terapia mirata. Finu à oghje, solu uni pochi di mudelli animali di MC sò stati segnalati per studià i miccanismi patologichi sottostanti.
Basatu annantu à a tiuria autoimmune pruposta da Albert è Ma, stu studiu hà stabilitu un mudellu MC di cunigliulu simplice è riproducibile autotrapiantendu NP vicinu à a placca vertebrale perforata. Altri obiettivi sò di osservà e caratteristiche istologiche di i mudelli animali è di valutà i meccanismi specifichi di NP in u sviluppu di MC. À questu scopu, usemu tecniche cum'è a biologia moleculare, a risonanza magnetica è studii istologichi per studià a progressione di MC.
Dui cunigli sò morti per via di sanguinamentu durante l'operazione, è quattru cunigli sò morti durante l'anestesia durante a risonanza magnetica. I 48 cunigli rimanenti sò sopravvissuti è ùn anu mostratu alcun segnu cumportamentale o neurologicu dopu l'operazione.
A risonanza magnetica mostra chì l'intensità di u signale di u tissutu incrustatu in i diversi fori hè diversa. L'intensità di u signale di u corpu vertebrale L5 in u gruppu NPE hè cambiata gradualmente à 12, 16 è 20 settimane dopu l'inserzione (a sequenza T1W hà mostratu un signale bassu, è a sequenza T2W hà mostratu un signale mistu più un signale bassu) (Fig. 1C), mentre chì l'aspettu di a risonanza magnetica di l'altri dui gruppi di parti incrustate hè rimasu relativamente stabile durante u listessu periodu (Fig. 1A, B).
(A) MRI sequenziali rappresentative di a spina lombare di u cunigliulu à 3 punti di tempu. Nisuna anomalia di signale hè stata trovata in l'imagine di u gruppu di operazione simulata. (B) E caratteristiche di u signale di u corpu vertebrale in u gruppu ME sò simili à quelle di u gruppu di operazione simulata, è ùn si osserva alcun cambiamentu significativu di signale in u situ di inclusione cù u tempu. (C) In u gruppu NPE, u signale bassu hè chjaramente visibile in a sequenza T1W, è u signale mistu è u signale bassu sò chjaramente visibili in a sequenza T2W. Da u periodu di 12 settimane à u periodu di 20 settimane, i signali alti sporadichi chì circundanu i signali bassi in a sequenza T2W diminuiscenu.
L'iperplasia ossea evidente pò esse osservata in u situ d'implantazione di u corpu vertebrale in u gruppu NPE, è l'iperplasia ossea si verifica più rapidamente da 12 à 20 settimane (Fig. 2C) paragunata à u gruppu NPE, nisun cambiamentu significativu hè osservatu in i corpi vertebrali modellati; Gruppu Sham è gruppu ME (Fig. 2C) 2A,B).
(A) A superficia di u corpu vertebrale à a parte impiantata hè assai liscia, u foru guarisce bè, è ùn ci hè micca iperplasia in u corpu vertebrale. (B) A forma di u situ impiantatu in u gruppu ME hè simile à quella in u gruppu di operazione simulata, è ùn ci hè micca cambiamentu evidente in l'aspettu di u situ impiantatu cù u tempu. (C) L'iperplasia ossea si hè verificata à u situ impiantatu in u gruppu NPE. L'iperplasia ossea hè aumentata rapidamente è s'hè ancu estesa attraversu u discu intervertebrale finu à u corpu vertebrale contralaterale.
L'analisi istologica furnisce infurmazioni più dettagliate nantu à a furmazione ossea. A figura 3 mostra e fotografie di e sezioni postoperatorie colorate cù H&E. In u gruppu di operazione simulata, i condrociti eranu ben disposti è ùn hè stata rilevata alcuna proliferazione cellulare (Fig. 3A). A situazione in u gruppu ME era simile à quella in u gruppu di operazione simulata (Fig. 3B). Tuttavia, in u gruppu NPE, un gran numeru di condrociti è una proliferazione di cellule simili à NP sò stati osservati in u situ di l'impiantu (Fig. 3C);
(A) E trabecule ponu esse viste vicinu à a piastra terminale, i condrociti sò disposti ordinatamente cù una dimensione è una forma cellulare uniformi è senza proliferazione (40 volte). (B) A cundizione di u situ d'impiantu in u gruppu ME hè simile à quella di u gruppu sham. E trabecule è i condrociti ponu esse visti, ma ùn ci hè micca una proliferazione evidente in u situ d'impiantu (40 volte). (B) Si pò vede chì i condrociti è e cellule simili à NP proliferanu significativamente, è a forma è a dimensione di i condrociti sò irregulari (40 volte).
L'espressione di l'mRNA di l'interleuchina 4 (IL-4), di l'mRNA di l'interleuchina 17 (IL-17) è di l'mRNA di l'interferone γ (IFN-γ) hè stata osservata in i gruppi NPE è ME. Quandu i livelli d'espressione di i geni bersagli sò stati paragunati, l'espressioni geniche di IL-4, IL-17 è IFN-γ sò state significativamente aumentate in u gruppu NPE paragunatu à quelle di u gruppu ME è di u gruppu d'operazione simulata (Fig. 4) (P < 0,05). Paragunatu à u gruppu d'operazione simulata, i livelli d'espressione di IL-4, IL-17 è IFN-γ in u gruppu ME sò aumentati solu ligeramente è ùn anu micca righjuntu un cambiamentu statisticu (P > 0,05).
L'espressione di l'mRNA di IL-4, IL-17 è IFN-γ in u gruppu NPE hà mostratu una tendenza significativamente più alta chè quella di u gruppu di operazione simulata è di u gruppu ME (P < 0,05).
In cuntrastu, i livelli d'espressione in u gruppu ME ùn anu mostratu alcuna differenza significativa (P> 0,05).
L'analisi Western blot hè stata realizata aduprendu anticorpi dispunibili cummercialmente contr'à IL-4 è IL-17 per cunfirmà u mudellu d'espressione di l'mRNA alteratu. Cum'è mostratu in e Figure 5A,B, paragunatu à u gruppu ME è u gruppu di operazione simulata, i livelli di proteine di IL-4 è IL-17 in u gruppu NPE eranu significativamente aumentati (P < 0,05). Paragunatu à u gruppu di operazione simulata, i livelli di proteine di IL-4 è IL-17 in u gruppu ME ùn sò ancu riesciuti à ghjunghje à cambiamenti statisticamente significativi (P> 0,05).
(A) I livelli di proteine di IL-4 è IL-17 in u gruppu NPE eranu significativamente più alti chè quelli di u gruppu ME è di u gruppu placebo (P < 0,05). (B) Istogramma di Western blot.
A causa di u numeru limitatu di campioni umani ottenuti durante a chirurgia, studii chjari è dettagliati nantu à a patogenesi di MC sò un pocu difficiuli. Avemu pruvatu à stabilisce un mudellu animale di MC per studià i so putenziali meccanismi patologichi. À u listessu tempu, a valutazione radiologica, a valutazione istologica è a valutazione biologica moleculare sò state aduprate per seguità u corsu di MC indotta da l'autotrapianto di NP. Di cunsiguenza, u mudellu d'impiantu di NP hà risultatu in un cambiamentu graduale di l'intensità di u signale da i punti di tempu di 12 settimane à 20 settimane (signale bassu mistu in sequenze T1W è signale bassu in sequenze T2W), indicendu cambiamenti tissutali, è e valutazioni istologiche è biologiche moleculari anu cunfirmatu i risultati di u studiu radiologicu.
I risultati di questu esperimentu mostranu chì i cambiamenti visuali è istologichi si sò verificati in u situ di a violazione di u corpu vertebrale in u gruppu NPE. À u listessu tempu, l'espressione di i geni IL-4, IL-17 è IFN-γ, è ancu IL-4, IL-17 è IFN-γ sò stati osservati, chì indicanu chì a violazione di u tissutu autologu di u nucleu pulposu in u corpu vertebrale pò causà una seria di cambiamenti di signale è morfologichi. Hè faciule truvà chì e caratteristiche di u signale di i corpi vertebrali di u mudellu animale (signale bassu in a sequenza T1W, signale mistu è signale bassu in a sequenza T2W) sò assai simili à quelle di e cellule vertebrali umane, è e caratteristiche di a MRI cunfermanu ancu l'osservazioni di l'istologia è di l'anatomia macroscopica, vale à dì, i cambiamenti in e cellule di u corpu vertebrale sò progressivi. Ancu se a risposta infiammatoria causata da un traumu acutu pò cumparisce pocu dopu a puntura, i risultati di a MRI anu mostratu chì i cambiamenti di signale progressivamente crescenti sò apparsi 12 settimane dopu a puntura è anu persistitu finu à 20 settimane senza alcun segnu di ripresa o inversione di i cambiamenti di a MRI. Questi risultati suggerenu chì a NP vertebrale autologa hè un metudu affidabile per stabilisce a MV progressiva in i cunigli.
Stu mudellu di puntura richiede cumpetenze, tempu è sforzu chirurgicu adeguati. In esperimenti preliminari, a dissezione o a stimulazione eccessiva di e strutture ligamentose paravertebrali pò purtà à a furmazione di osteofiti vertebrali. Ci vole à fà attenzione à ùn dannà o irrità i dischi adiacenti. Siccomu a prufundità di penetrazione deve esse cuntrullata per ottene risultati consistenti è riproducibili, avemu fattu manualmente un tappu tagliendu a guaina di un agulla longa 3 mm. L'usu di stu tappu assicura una prufundità di perforazione uniforme in u corpu vertebrale. In esperimenti preliminari, trè chirurghi ortopedichi implicati in l'operazione anu trovu chì l'aghi di calibru 16 eranu più faciuli da travaglià chè l'aghi di calibru 18 o altri metudi. Per evità un sanguinamentu eccessivu durante a perforazione, tene l'agulla ferma per un pezzu furnisce un foru d'inserzione più adattatu, ciò chì suggerisce chì un certu gradu di MC pò esse cuntrullatu in questu modu.
Ancu s'è parechji studii anu miratu à MC, si sà pocu nantu à l'etiologia è a patogenesi di MC25,26,27. Basatu annantu à i nostri studii precedenti, avemu trovu chì l'autoimmunità ghjoca un rolu chjave in l'apparizione è u sviluppu di MC12. Questu studiu hà esaminatu l'espressione quantitativa di IL-4, IL-17 è IFN-γ, chì sò e principali vie di differenziazione di e cellule CD4+ dopu a stimulazione di l'antigene. In u nostru studiu, paragunatu à u gruppu negativu, u gruppu NPE avia una più alta espressione di IL-4, IL-17 è IFN-γ, è ancu i livelli di proteine di IL-4 è IL-17 eranu più alti.
Clinicamente, l'espressione di l'mRNA di l'IL-17 hè aumentata in e cellule NP di i pazienti cun ernia discale28. Livelli aumentati di espressione di IL-4 è IFN-γ sò stati ancu trovati in un mudellu di ernia discale acuta non compressiva paragunatu à i cuntrolli sani29. L'IL-17 ghjoca un rolu chjave in l'inflammazione, a ferita tissutale in e malatie autoimmune30 è migliora a risposta immune à l'IFN-γ31. Una ferita tissutale mediata da IL-17 migliorata hè stata segnalata in topi MRL/lpr32 è topi suscettibili à l'autoimmunità33. L'IL-4 pò inibisce l'espressione di citochine proinfiammatorie (cum'è IL-1β è TNFα) è l'attivazione di i macrofagi34. Hè statu segnalatu chì l'espressione di l'mRNA di l'IL-4 era diversa in u gruppu NPE paragunatu à IL-17 è IFN-γ à u listessu tempu; L'espressione di l'mRNA di IFN-γ in u gruppu NPE era significativamente più alta di quella in l'altri gruppi. Dunque, a pruduzzione di IFN-γ pò esse un mediatore di a risposta infiammatoria indotta da l'intercalazione di NP. Studi anu dimustratu chì l'IFN-γ hè pruduttu da parechji tipi di cellule, cumprese e cellule T helper di tipu 1 attivate, e cellule killer naturali è i macrofagi35,36, è hè una citochina pro-infiammatoria chjave chì prumove risposte immunitarie37.
Stu studiu suggerisce chì a risposta autoimmune pò esse implicata in l'apparizione è u sviluppu di MC. Luoma et al. anu trovu chì e caratteristiche di u signale di MC è NP prominente sò simili in MRI, è tramindui mostranu un signale altu in a sequenza T2W38. Alcune citochine sò state cunfirmate cum'è strettamente assuciate cù l'apparizione di MC, cum'è IL-139. Ma et al. anu suggeritu chì a protrusione ascendente o discendente di NP pò avè una grande influenza nantu à l'apparizione è u sviluppu di MC12. Bobechko40 è Herzbein et al.41 anu riportatu chì NP hè un tissutu immunotollerante chì ùn pò micca entre in a circulazione vasculare da a nascita. E protrusioni NP introducenu corpi stranieri in l'approvvigionamentu di sangue, mediandu cusì reazioni autoimmuni lucali42. E reazioni autoimmuni ponu induce un gran numeru di fattori immunitari, è quandu questi fattori sò continuamente esposti à i tessuti, ponu causà cambiamenti in a segnalazione43. In questu studiu, a sovraespressione di IL-4, IL-17 è IFN-γ sò fattori immunitari tipici, chì dimostranu ulteriormente a stretta relazione trà NP è MC44. Stu mudellu animale imita bè a penetrazione di NP è l'entrata in a placca terminale. Stu prucessu hà rivelatu ancu di più l'impattu di l'autoimmunità nantu à MC.
Cum'è previstu, questu mudellu animale ci furnisce una pussibile piattaforma per studià a MC. Tuttavia, questu mudellu hà sempre qualchì limitazione: prima, durante a fase d'osservazione di l'animali, certi cunigli in stadiu intermediu devenu esse eutanasizati per testi istologichi è di biologia moleculare, dunque certi animali "perdenu di usu" cù u tempu. Siconda, ancu s'è trè punti temporali sò stabiliti in questu studiu, sfurtunatamente, avemu modellatu solu un tipu di MC (cambiamentu di tipu Modic I), dunque ùn hè micca abbastanza per rapprisintà u prucessu di sviluppu di a malatia umana, è più punti temporali devenu esse stabiliti per osservà megliu tutti i cambiamenti di signale. Terzu, i cambiamenti in a struttura di i tessuti ponu esse effettivamente mostrati chjaramente da a culurazione istologica, ma alcune tecniche specializate ponu rivelà megliu i cambiamenti microstrutturali in questu mudellu. Per esempiu, a microscopia à luce polarizzata hè stata aduprata per analizà a furmazione di fibrocartilagine in i dischi intervertebrali di cunigli45. L'effetti à longu andà di NP nantu à MC è a placca terminale richiedenu ulteriori studii.
Cinquantaquattru cunigli bianchi masci di Nova Zelanda (pesu circa 2,5-3 kg, età 3-3,5 mesi) sò stati divisi à casu in gruppu di operazione simulata, gruppu d'impiantu musculare (gruppu ME) è gruppu d'impiantu di radiche nervose (gruppu NPE). Tutte e procedure sperimentali sò state appruvate da u Cumitatu Eticu di l'Ospedale di Tianjin, è i metudi sperimentali sò stati realizati in stretta cunfurmità cù e linee guida appruvate.
Certi miglioramenti sò stati fatti à a tecnica chirurgica di S. Sobajima 46. Ogni cunigliulu hè statu piazzatu in una pusizione laterale di recumbenza è a superficia anteriore di cinque dischi intervertebrali lumbari (IVD) consecutivi hè stata esposta aduprendu un approcciu posterolaterale retroperitoneale. Ogni cunigliulu hè statu sottumessu à anestesia generale (20% uretanu, 5 ml/kg via a vena di l'arechja). Una incisione longitudinale di a pelle hè stata fatta da u bordu inferiore di e coste à u bordu pelvicu, 2 cm ventrale à i musculi paravertebrali. A spina anterolaterale destra da L1 à L6 hè stata esposta da una dissezione affilata è smussa di u tissutu sottutanea sovrastante, di u tissutu retroperitoneale è di i musculi (Fig. 6A). U livellu di u discu hè statu determinatu aduprendu u bordu pelvicu cum'è puntu di riferimentu anatomicu per u livellu di u discu L5-L6. Aduprate un agulla di puntura di calibru 16 per perforà un foru vicinu à a piastra terminale di a vertebra L5 à una prufundità di 3 mm (Fig. 6B). Aduprate una siringa di 5 ml per aspirà u nucleu pulposu autologu in u discu intervertebrale L1-L2 (Fig. 6C). Eliminate u nucleu pulposu o u musculu secondu i bisogni di ogni gruppu. Dopu chì u foru di perforazione hè statu prufunditu, i punti di sutura assorbibili sò posti nantu à a fascia prufonda, a fascia superficiale è a pelle, fendu attenzione à ùn dannà u tissutu periostale di u corpu vertebrale durante l'operazione.
(A) U discu L5-L6 hè espostu per via di un approcciu retroperitoneale posterolaterale. (B) Aduprate un agulla di calibru 16 per perforà un foru vicinu à a placca terminale L5. (C) I MF autologhi sò prelevati.
L'anestesia generale hè stata amministrata cù uretanu à 20% (5 ml/kg) amministratu per via di a vena di l'arechja, è e radiografie di a spina lombare sò state ripetute à 12, 16 è 20 settimane dopu l'operazione.
I cunigli sò stati sacrificati per iniezione intramusculare di ketamina (25,0 mg/kg) è pentobarbital sodicu intravenosu (1,2 g/kg) à 12, 16 è 20 settimane dopu l'operazione. Tutta a spina dorsale hè stata rimossa per l'analisi istologica è hè stata effettuata una vera analisi. A trascrizione inversa quantitativa (RT-qPCR) è u Western blotting sò stati aduprati per rilevà i cambiamenti in i fattori immunitari.
L'esami MRI sò stati realizati in cunigli aduprendu un magnetu clinicu di 3,0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) equipatu cù un ricevitore di bobina ortogonale per l'arti. I cunigli sò stati anestetizzati cù 20% di uretanu (5 mL/kg) via a vena di l'arechja è dopu posti in supinu in u magnetu cù a regione lombare centrata nantu à una bobina di superficia circulare di 5 pollici di diametru (GE Medical Systems). L'imaghjini di u localizatore ponderate in T2 coronale (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) sò state acquistate per definisce a pusizione di u discu lombare da L3-L4 à L5-L6. E sezioni ponderate in T2 di u pianu sagittale sò state acquistate cù e seguenti impostazioni: sequenza di spin-echo rapida cù un tempu di ripetizione (TR) di 2200 ms è un tempu d'ecu (TE) di 70 ms, matrice; campu visuale di 260 è ottu stimuli; U spessore di u tagliu era di 2 mm, u spaziu era di 0,2 mm.
Dopu chì l'ultima fotografia hè stata scattata è l'ultimu cunigliulu hè statu tombu, i dischi simulati, inclusi in i musculi è NP sò stati rimossi per l'esame istologicu. I tessuti sò stati fissati in formalina tamponata neutra à u 10% per 1 settimana, decalcificati cù l'acidu etilendiamminotetraaceticu è sezionati in paraffina. I blocchi di tissutu sò stati inclusi in paraffina è tagliati in sezioni sagittali (5 μm di spessore) aduprendu un microtomu. E sezioni sò state colorate cù ematossilina è eosina (H&E).
Dopu avè raccoltu i dischi intervertebrali da i cunigli in ogni gruppu, l'ARN tutale hè statu estrattu aduprendu una colonna UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Cina) secondu l'istruzzioni di u fabricatore è un sistema di trascrizione inversa ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, USA). A trascrizione inversa hè stata effettuata.
RT-qPCR hè stata realizata cù un Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) è SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. U vulume di reazione PCR era 20 μl è cuntene 1,5 μl di cDNA diluitu è 0,2 μM di ogni primer. I primer sò stati cuncipiti da OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) è fabbricati da Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Cina) (Tavula 1). Sò state aduprate e seguenti cundizioni di ciclu termicu: passu iniziale di attivazione di a polimerasi à 94°C per 2 min, dopu 40 cicli di 15 s ognunu à 94°C per a denaturazione di u mudellu, annealing per 1 min à 60°C, estensione è fluorescenza. E misurazioni sò state realizate per 1 min à 72°C. Tutti i campioni sò stati amplificati trè volte è u valore mediu hè statu utilizatu per l'analisi RT-qPCR. I dati di amplificazione sò stati analizati cù FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). L'espressione di i geni IL-4, IL-17 è IFN-γ hè stata nurmalizzata à u cuntrollu endogenu (ACTB). I livelli di espressione relativi di l'mRNA bersagliu sò stati calculati cù u metudu 2-ΔΔCT.
A proteina tutale hè stata estratta da i tessuti aduprendu un omogeneizzatore di tessuti in un buffer di lisi RIPA (chì cuntene un cocktail d'inibitori di proteasi è fosfatasi) è dopu centrifugata à 13.000 rpm per 20 minuti à 4 °C per rimuovere i detriti tissutali. Cinquanta microgrammi di proteina sò stati caricati per corsia, separati da SDS-PAGE à 10%, è dopu trasferiti à una membrana PVDF. U bloccu hè statu realizatu in latte scrematu in polvere à 5% in soluzione salina tamponata cù Tris (TBS) chì cuntene 0,1% di Tween 20 per 1 ora à temperatura ambiente. A membrana hè stata incubata cù un anticorpu primariu di cunigliulu anti-decorina (diluitu 1:200; Boster, Wuhan, Cina) (diluitu 1:200; Bioss, Pechino, Cina) durante a notte à 4 °C è hà reagitu u secondu ghjornu; cù anticorpu secundariu (immunoglobulina G di capra anti-cunigliu à diluzione 1:40.000) cumminatu cù perossidasi di rafano (Boster, Wuhan, Cina) per 1 ora à temperatura ambiente. I signali Western blot sò stati rilevati da una chemiluminescenza aumentata nantu à a membrana chemiluminescente dopu l'irradiazione à raggi X. Per l'analisi densitometrica, i blot sò stati scansionati è quantificati cù u software BandScan è i risultati sò stati espressi cum'è u rapportu trà l'immunoreattività di u genu bersagliu è l'immunoreattività di a tubulina.
I calculi statistici sò stati realizati cù u pacchettu software SPSS16.0 (SPSS, USA). I dati raccolti durante u studiu sò stati espressi cum'è media ± deviazione standard (media ± SD) è analizati cù l'analisi di varianza à misure ripetute unidirezionali (ANOVA) per determinà e differenze trà i dui gruppi. Un valore P < 0,05 hè statu cunsideratu statisticamente significativu.
Cusì, a creazione di un mudellu animale di MC impiantendu NP autologhe in u corpu vertebrale è realizendu osservazioni macroanatomiche, analisi MRI, valutazione istologica è analisi biologica moleculare pò diventà un strumentu impurtante per valutà è capisce i meccanismi di MC umana è sviluppà novi interventi terapeutici.
Cumu citallu st'articulu: Han, C. et al. Un mudellu animale di cambiamenti Modic hè statu stabilitu impiantendu u nucleu pulposu autologu in l'ossu subcondrale di a spina lombare. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., è Boos, N. Risonanza magnetica di a spina lombare: prevalenza di ernia è ritenzione discale, cumpressione di e radiche nervose, anomalie di a placca terminale è osteoartrite di l'articulazione facettare in vuluntarii asintomatici. tasso. Radiologia 209, 661–666, doi:10.1148/radiologia.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, è Leboeuf-Eed, K. Cambiamenti modichi è a so relazione cù i risultati clinichi. European Spine Journal: publicazione ufficiale di a Società Europea di a Spina, a Società Europea di Deformità Spinale è a Società Europea per a Ricerca di a Spina Cervicale 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Cambiamenti modichi in e placche terminali vertebrali lumbari: prevalenza è associazione cù u dolore lombare è a sciatica in i travagliadori maschili di mezza età. Spine 32, 1116–1122, doi: 10.1097 / 01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., è Dalinka, M. MRI di i cambiamenti di u midullu osseu vicinu à a piastra terminale in a malatia degenerativa di a spina lombare. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, è Carter, JR Malattia degenerativa di u discu: valutazione di i cambiamenti di u midullu vertebrale cù a risonanza magnetica. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, è Carter, JR Imaging di a malatia degenerativa di u discu. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. I predittori di a placca terminale neovertebrale (Modic) signalanu cambiamenti in a pupulazione generale. European Spine Journal: Pubblicazione ufficiale di a Società Europea di a Spina, a Società Europea di Deformità Spinale è a Società Europea per a Ricerca di a Spina Cervicale, Divisione 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB è Mannisch, K. Cambiamenti modichi dopu à ernia di u discu lumbar. European Spine Journal: Pubblicazione ufficiale di a Società Europea di a Spina, a Società Europea di Deformità Spinale è a Società Europea per a Ricerca di a Spina Cervicale 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., è Kaapa, E. I cambiamenti di tipu Modic I ponu prevede a degenerazione di u discu deformazionale rapidamente progressiva: un studiu prospetticu di 1 annu. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ è Fan, SW Cambiamenti modichi: cause pussibuli è cuntribuzione à a degenerazione di u discu lombare. Ipotesi Mediche 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Rottura interna di u discu. Prublemi di prolapse di u discu in più di 50 anni. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Data di publicazione: 13 dicembre 2024